主题： 花粉管检测-NMT应用成果

ATP不仅是活细胞的能量来源，也是植物细胞信号转导途径中的重要物质。大量的证据表明胞外的ATP（eATP）调节植物的膜电势、气孔开度、棉花纤维的伸长、根毛和花粉管的生长、生长素的转运、基因表达和细胞活性。eATP调节高等植物细胞活性和病原防御反应。但是，ATP的信号转导过程和参与的植物程序性细胞死亡（PCD）的分子网络还没阐明。


2011年，北京林业大学的陈少良教授实验室使用非损伤微测技术、激光共聚焦显微镜等方法研究了eATP诱导的PCD信号转导途径，发现eATP激活胡杨的程序性细胞死亡，出现细胞质皱缩、染色质聚集和DNA片段化。同时胞质中Ca²⁺升高，导致H₂O₂积累，线粒体跨膜电势增加，细胞色素c释放。而且，eATP诱导胞内ATP增加，这对半胱氨酸水解酶和随后的PCD必不可少，与线粒体跨膜电势的增加有关。因此，根据研究结果推测ATP是通过结合质膜上的嘌呤受体，引起下游中间信号反应，这种PCD信号被动物P2受体拮抗剂suramin所终止。


这项研究阐述了胡杨PCD中的ATP信号途径，建立了eATP诱导PCD的模型，为进一步认识ATP的信号网络提供了必不可少的证据。此研究和活体测定方法也为其他类似的研究提供了思路，例如H₂O₂、谷氨酸（Glu）等新的信号途径的研究。

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2011年3月17日，葡萄牙里斯本大学José Feijó教授的研究成果在世界知名杂志《Science》以“Research Article”的形式在线发表，中国农业大学资源环境学院的刘来华教授参与了本项研究。细胞内游离Ca²⁺的增加构成了真核细胞基本的信号转导机制，但是Ca²⁺通道蛋白如何启动信号一直存在争论。


在这项研究中科学家使用非损伤微测技术（vibrating microelectrodes or NMT）测定了氨基酸刺激后花粉管的Ca²⁺流动，直接证实了植物中具有和动物中相似的神经传递系统。发现谷氨酸受体类似基因（GLRs）减少了通过质膜的Ca²⁺内流，进而调节花粉管顶端胞质中的Ca²⁺浓度梯度，最终影响花粉管的生长和形态建成。此外，敲除花粉管丝氨酸消旋酶（SR1的突变体）后GLRs活性下降，导致生长发生缺陷。这项研究揭示了氨基酸调节雄性配子体和雌蕊组织之间全新的信号转导机制，类似于动物神经系统的常见机制。这不仅是植物学的重大发现，对动物学、医学等其他领域的研究也具有很大的参考价值。


非损伤微测技术（NMT，www.xuyue.net）是一种活体研究技术，无需标记就可以实时地获取离子和小分子的流速，是研究活体信号转导和神经传递系统的最佳手段之一。José Feijó实验室近年来使用非损伤微测技术在高水平杂志发表了多篇论文。本次发表的论文是该实验室研究工作的代表，也标志着非损伤微测技术的应用越来越广泛，产生的成果越来越有影响力。

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为了应对不良环境中的生殖问题，植物发展出了一套非常独特的生殖系统，通过自然界生长最快的细胞花粉管进行高等植物典型的双受精来完成生殖。花粉管的生长依赖于基本的生物学功能，且与离子动力学的调控密切相关，也就是胞外的离子流和胞内的游离离子浓度，即Ca²⁺和H⁺。


从1995年到2009年的15年间，葡萄牙的科学家Feijó实验室研究了花粉管生长过程中的离子调控，发现烟草花粉管是非常好的模式材料，非损伤微测技术和荧光技术是研究离子调控的最佳手段。科学家从基础生物物理学、细胞生物学到基因和转录组学对花粉管的发育进行了研究，发现调节花粉管离子转运的关键因素有膜电势、膜的伸展、pH、K⁺、Ca²⁺、翻译后修饰、离子转运网络和交叉信号途径，这些因素通过Ca²⁺和H⁺的空间分布和时间转换调节细胞的极性和生长。这些结果说明离子调控的动力学可能是引起细胞发育的基本原因，也是花粉管快速的生长内在机制。


因此，使用非损伤微测技术研究活体细胞生长过程中的信号及其时空转换机制，对深入了解植物发育的机理，利用分子工具对某些过程进行设计，产生更加有利的受精和发育等都具有重要的意义，同时花粉管作为研究细胞相互作用、信号转导、极性生长的模式系统也具有理论意义。

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自交不亲和性（Self-Incompatibility, SI）是指某一植物的雌雄两性机能正常，但不能进行自花受精或同一品系内异株花粉受精的现象。自交不亲和性是广泛存在于显花植物中的一种种内生殖障碍，对于物种避免近亲交配和保持遗传多样性具有重要意义。在过去的十多年中，科学家发现不亲和的罂粟花粉中胞内自由Ca²⁺的增加可以激发自交不亲和性反应。然而，胞外的Ca²⁺是否参与这个过程，一直没有得到证实。


近来，研究人员使用非损伤微测技术测定了罂粟花粉管的Ca²⁺流说明了这一问题。研究发现Ca²⁺内流和振荡在花粉管生长中出现，自交不亲和性蛋白（S蛋白：14kD）能够刺激Ca²⁺内流，这个内流的部位在花粉管尖端后的50mm处。这些SI诱导的Ca²⁺内流说明了在SI反应中胞内Ca²⁺的增加是由于胞外的Ca²⁺进入细胞而引起。同时发现，Ca²⁺通道抑制剂Gd³⁺和La³⁺抑制花粉管正常的Ca²⁺内流和振荡，抑制花粉管生长。


非损伤微测技术对于研究自交不亲和性有无可比拟的优势，活体、动态地检测细胞的振荡信号，并且可以得到真实、稳定的Ca²⁺信号。

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花粉管生长是生物系统中自发组织的一个重要实例。在这些自发系统中，通过交互反馈通路传递信号，从而控制并调整分子及生化参数使之最适于生长和发挥作用。花粉作为一种研究植物细胞发育、生长以及生物生理学的模式材料，发现花粉管的振荡生长与Ca²⁺、H⁺、K⁺三种阳离子振荡内流有关。


在哺乳动物分泌细胞中，Cl^-通道作为重要的调节者调控分泌活动并维持细胞体积。已经证明肌醇3,4,5,6-四磷酸盐负调控Ca²⁺激活Cl^-通道。不同的肌醇磷酸盐作用于花粉管时，肌醇3,4,5,6-四磷酸盐的作用最强。


Feijó等研究人员应用非损伤微测技术探索了肌醇3,4,5,6-四磷酸盐和Cl^-流之间的潜在关系。研究发现，在烟草和百合花粉管尖端出现振荡的Cl^-外流，从距尖端12μm开始沿着花粉管出现持续内流。氯通道阻断剂DIDS（4,4’-diisothiocyanatostilbene- 2,2‘-disulfonicacid）和5-硝基-2-(3-苯丙氨基)-苯甲酸（5-nitro-2-(3- phenylpropylamino)benzoicacid）分别在80μM和20μM时能够完全抑制烟草花粉管生长，诱导细胞体积增大，扰乱尖端Cl^-外流。另外，肌醇3,4,5,6-四磷酸盐编码的信号不利于花粉管生长，并可诱导细胞体积增大，扰乱正常的Cl^-振荡外流。相关分析表明Cl^-外流的周期在时间上与生长周期吻合，且生长周期中Cl^-外流与囊泡运动有关。


这一研究对于认识调控花粉管平衡和生长网络中的Cl^-动力学非常重要。

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显花植物的授粉是一个复杂的发育过程，整个过程受到严格的遗传和细胞控制，胞外信号起到了关键的调控作用。这些信号包括Ca²⁺、pH、肌动蛋白细胞骨架\cAMP和GTPase等等，《Science》展望了离子动力学作为一种新的研究方法来解释花粉管生长中的调控过程。Ca²⁺、K⁺、H⁺(pH)和Cl^-影响花粉管的生长，指引生长的方向。


胞外信号和胞内物质的相互作用决定了花粉管的生长方向。生物体作为一个精细的活体结构，能够恰当地选择离子和分子，进行一个非常聪明的离子和分子的工程。在生理状态下无损伤、非接触或者半损伤的测量方式非常有利于真正揭示胞外信号的作用。


目前，使用非损伤微测技术可以无损伤、非接触地动态测定花粉管或其他样品的离子流，为探索胞外的信号对生物体的作用提供了最直接的手段。多篇文章已经发表在《Plant Cell》、《Plant Physiology》等国际著名杂志。

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Ca²⁺和H⁺在花粉管生长、定向伸长及形态形成方面起重要作用，花粉管中分化细胞的伸长需要Ca²⁺和H⁺的浓度梯度的存在。由于百合不易构建稳定的转基因体系，因此并不适合作为分子遗传研究的模式植物，而烟草转基因及细胞生物学方面的研究较为深入，其花粉管也便于获得，因此更适合作为花粉管研究的模式材料。


葡萄牙科学家Feijó和Michard等研究人员用烟草作为实验材料，瞬时表达了pHluorin和黄色Cameleon蛋白作为探针分别用于胞内H⁺和Ca²⁺的比例成像分析，H⁺和Ca²⁺离子流通过非损伤微测技术流获得，并应用傅立叶分解法及连续小波分析法分析花粉管伸长期间离子浓度梯度、离子流及生长速率。结果表明，烟草花粉管尖端存在一个0.4pH单位的梯度，而且花粉管上存在一个亚尖端的碱化区域。胞外质子流振荡大约在10～40pmol·cm^-2·s^-1，花粉管胞内及胞内H⁺振荡存在一个或两个峰，Ca²⁺在花粉管尖端存在一个0.2～1.0uM的离子浓度梯度，振荡周期为1～4min，胞外的Ca²⁺流振荡大约在2～50pmol·cm^-2·s^-1。共聚焦及宽谱显微观察表明，花粉管细胞内的H⁺和Ca²⁺的模式和形状有所差异。


这项研究应用非损伤微测技术和荧光指示蛋白使花粉管H⁺和Ca²⁺的研究精度得以提高，是分子生物学手段与生理检测手段结合研究花粉管的一个范例。

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一氧化氮（NO）在植物的生长发育过程中具有非常重要的作用。近日，中科院植物所林金星研究组深入研究了裸子植物白皮松花粉管生长过程中，NO对Ca²⁺、微丝骨架、囊泡转运和细胞壁构建的调节作用。


NO作为重要的信号分子，参与调控花粉管极性生长。通过应用显微注射、非损伤微测、免疫荧光标记等技术发现NO释放剂促进花粉萌发和花粉管伸长，并且具有浓度效应，而抑制剂则抑制花粉萌发和花粉管生长，同时使花粉管顶端膨大，丧失极性；NO释放剂促进胞外Ca²⁺内流，顶端Ca²⁺浓度梯度增加，NO抑制剂抑制胞外Ca²⁺内流，顶端Ca²⁺浓度梯度降低。


此外，NO释放剂促进囊泡运输，使花粉管顶端微丝束解聚，NO抑制剂具有相反的作用，同时NO使花粉管顶端酯化果胶增加而酸性果胶降低。


在白皮松花粉管中，NO促进胞外Ca²⁺内流，从而维持胞内Ca²⁺浓度梯度，进而影响花粉管顶端微丝骨架的组装，促进囊泡运输，使花粉管顶端酯化果胶累积，最终促进花粉管的正常生长。通过Ca²⁺流和细胞学实验结果，全面地认识了NO在花粉管中极性生长中的功能。

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钙调素(CaM) 是调控细胞中各种代谢和信号途径的重要功能分子。然而对在Ca²⁺-CaM的信号转导过程中的蛋白质表达模式和细胞结构的变化却了解不足。


2009年2月，中科院植物所林金星研究组在《Plant physiology》发表文章，使用电镜技术、蛋白质组学技术、荧光技术结合非损伤微测技术提供了全面的结果，分析了CaM的功能和蛋白表达模式。发现抑制Ca²⁺-CaM时快速诱导了胞外Ca²⁺的内流，导致胞内Ca²⁺浓度的急剧增加和花粉管超微结构的异常，随后肌动蛋白丝解聚，内吞和胞外分泌紊乱，细胞壁结构改变，最后导致花粉管生长混乱。


这项研究的结果能够从信号转导的相互关系、能量产生途径和伸长机制方面深入理解Ca²⁺-CaM在裸子植物花粉管发育中的功能。

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植物通过细胞分裂和分化进行生长，大多数植物细胞分化期间需要剧烈地伸展，细胞在尖端形成新的细胞膜和细胞壁，例如花粉管和根毛。许多细胞沿着轴向首先出现了极性生长。NAA（萘乙酸）可以启动烟草细胞的极性，那么细胞是如何从极轴开始生长和伸长的？


为了回答这个问题，使用活体测定技术——非损伤微测技术测定了细胞的电流和离子流，以及生长素的情况。实验发现正在生长的细胞具有活跃的尖端，但是H⁺离子流没有统一的极性模式。而且，胞内的Ca²⁺浓度没有特殊的模式，也没有极性分布。TIBA是生长素极性运输的抑制剂，抑制了细胞的伸长。因此，生长素的外流启动一个信号过程，触发信号分子，促进纤维素在细胞壁的沉积，导致细胞极性和细胞伸长生长。


生长素的外流在烟草细胞中是启动极性生长的第一步，这可能建立了一个细胞中的极轴和触发了一个未知的信号转导途径。使用非损伤微测技术为此活细胞的极性生长研究提供可能。

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阴离子转运体在植物细胞生物学中扮演着基本的生物学作用，特别在气孔关闭和营养吸收方面。但是关于这些转运体和他们的定位、分子本质仍然知道的不多。


葡萄牙的科学家Feijo等人总结了植物细胞中阴离子转运的基本作用，特别是阴离子如何控制花粉管的生长。花粉管是研究细胞极性的模式材料，使用非损伤微测技术（NMT）可以揭示花粉管的生长受到不同的离子流种类和分布的控制。现有的数据表明Cl^-通过质膜的转运在花粉管萌发和生长中起到重要作用。在花粉管生长过程中，尖端的Cl^-出现显著的振荡，并且伴随着H⁺的周期性变化。


因此，我们通过非损伤微测技术研究调控花粉管信号系统的空间和时间模型，这种调控依赖于胞外的离子流和胞内的离子梯度。非损伤微测技术现在可以测定Cl^-和NO₃^-两种最主要的阴离子，这为我们研究阴离子的作用提供了便利的工具。