转自中关村旭月非损伤微测技术产业联盟

 

 

 

 

基本信息

主题：NMT验证根瘤促多氯联苯降解

期刊：Environmental Science and Technology

影响因子：6.653（2018年）

研究使用平台：NMT植物-微生物互作创新平台

标题：Coupling between Nitrogen Fixation and Tetrachlorobiphenyl Dechlorination in a Rhizobium−Legume Symbiosis

作者：中科院南京土壤研究所滕应、骆永明、王笑咪

 

检测离子/分子指标

Cl^-

 

检测样品

紫苜蓿根

 

中文摘要（谷歌机翻）

      豆科植物根瘤菌共生酶有潜力修复被氯代有机化合物污染的土壤。在这里，紫花苜蓿和苜蓿中华根瘤菌之间的共生模型被用来探讨共生氮固定与四氯联苯多氯联苯77（PCB 77）转化之间的关系。用5 mg L^-1 PCB 77预处理45日龄的幼苗5 d。在补充了PCB的节结中，添加固氮钼酸盐后脱氯作用增强了7.2倍，并减少了PCB 77的组织积累（根部增加了96%，根瘤减少了93%）。相反，暴露于固氮酶抑制剂（硝酸盐）或具有固氮酶缺陷的共生体（nifA突变体）的植物中的脱氯作用分别降低了29%和72%。在固氮条件下，在根瘤和根中检测到一系列脱氯产物（联苯，甲基联苯，羟基联苯和三氯联苯衍生物）。固氮酶衍生的氢和血红蛋白的表达水平与结节脱氯率呈正相关，表明减少的环境促进了PCB脱氯。本研究的发现首次证明了共生固氮作用是四氯联苯脱氯的驱动力。反过来，这为使用根瘤菌增强卤代有机化合物的植物修复开辟了新的可能性。

 

离子/分子流实验处理

多氯联苯（PCB，一种人类致癌物和环境毒素的持久性有机污染物）处理5 d后，用不同的药剂（10 mM KNO₃、10 mM KNO₂和0.25 mM Na₂MoO₄）处理植物5 d。

 

离子/分子流实验结果

      通过对Cl^-的净流速进行量化，测定了由PCB 77补充的微好氧根瘤的脱氯活性（图1B）。PCB的添加导致菌株WT接种根瘤中Cl^-外排速率明显增加（P＜0.05），表明该化合物在微氧类细菌内被脱氯。与N₂固定活性一致，MoO₄^2-处理后相对于对照，Cl^-外排速率增加了7.2倍（P <0.05）。相比之下，添加NO₃^-后，Cl^-的平均外排速率与对照（WT+PCB）相比降低了29%（P <0.05），而在NO₂^-处理后，其Cl^-外排速率的平均值仅略有变化（P>0.05）。在植株中缺少缺乏固氮酶活性的nifA突变体的植株中，Cl^-外排速率比WT处理低72%（P<0.05）。然而在突变组中，PCB处理后，Cl^-外排没有显著增加（P>0.05），表明在这些条件下脱氯作用可能很弱。

 

 

图1.紫苜蓿根瘤净Cl^-流速。正值代表Cl^-外排，负值代表Cl^-吸收。

注：WT代表接种苜蓿中华根瘤菌NM野生型的紫苜蓿；Smy代表接种苜蓿中华根瘤菌NM nifA突变体的紫苜蓿。

 

文章简介

2018年年初，中科院南京土壤研究所滕应研究员、骆永明研究员针对植物修复多氯联苯（PCBs）污染的研究成果，在Environmental Science &Technology (IF 6.653)上发表，研究标题为“Coupling between nitrogen fixation and tetrachlorobiphenyl dechlorination in a rhizobium-legume symbiosis”。这是利用非损伤微测技术开展植物修复PCBs污染研究的第一篇文章。

PCBs的化学性质非常稳定，很难在自然界分解，属于持久性有机污染物的一类，多用于电力设备，如含有多氯联苯的电容器、电压器等。目前处理PCBs的方法主要有掩埋法、微生物去除法、化学法、物理法、焚烧法、植物根际修复法。其中，植物根基修复法是当下兴起的一种新修复方式，是利用植物与根际微生物的相互作用来降解多氯联苯，修复效果明显。

根瘤是豆科植物的固氮组织，其中定殖的根瘤菌能够固氮。课题组前期研究发现，紫花苜蓿的根瘤，能够富集有机污染物PCBs。在本研究中进一步发现，根瘤固氮能力的提高，能够促进PCBs的脱氯和降解转化。其中，脱氯效果的鉴定，除了采用了传统的脱氯产物检测进行确定外，还创新性的利用非损伤微测技术，测定了苜蓿根瘤Cl^-的释放量，直接反映出脱氯效果。

 

仪器采购信息

据中关村NMT产业联盟了解，江苏地区的中国科学院南京土壤研究所于2017年采购了美国扬格公司的非损伤微测系统。

 

 

 

 

原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.est.7b05667

 

关键词：固氮；根瘤菌；多氯联苯；植物修复；脱氯

 

 

 

 

 

 

转自中关村旭月非损伤微测技术产业联盟

 

 

 

 

基本信息

主题：NMT发现外生菌根可促灰杨吸Cd²⁺提升Cd²⁺耐受能力

期刊：Plant Cell and Environment

影响因子：6.362

研究使用平台：NMT植物-微生物互作创新平台

标题：Ectomycorrhizas with Paxillus involutus enhance cadmium uptake and tolerance in Populus × canescens

作者：西北农林科技大学罗志斌（现中国林科院林业研究所）、马永禄

 

检测离子/分子指标

Cd²⁺，H⁺

 

检测样品

灰杨根

 

中文摘要（谷歌机翻）

      外生菌根（EMs）是树根和某些真菌之间形成的共生器官，可以介导寄主植物对镉（Cd）的耐受性，但其潜在的生理和分子机制尚不完全清楚。为了研究木本植物中EMs介导的对Cd的耐受性，用渐生Paxillus involutus（MAJ菌株）接种Populus × canescens来建立菌根。菌根杨树和非菌根对照暴露于0或50 μM CdSO₄中。EMs的净Cd²⁺内流速率高于非菌根。净Cd²⁺内流与净H⁺外排相结合，质膜（PM）H⁺-ATPase的失活降低了EM对Cd²⁺的吸收，而无菌根则更少。与EMs较高的Cd²⁺吸收一致，在大多数情况下，与非菌根相比，EMs中参与Cd²⁺吸收，转运和解毒过程的基因的转录水平增加。尽管Cd²⁺积累较高，但与非菌根杨树相比，菌根中的CO₂同化程度更高，营养和碳水化合物状况得到改善，并且氧化应激得到缓解。这些结果表明，菌根增加了Cd²⁺的吸收，可能是由于根体积增大和与Cd²⁺吸收和运输有关的基因的过表达，并同时增强了Po.×canescens通过增加排毒，改善营养素和碳水化合物的状况以及防御准备来降低蔗糖对镉的耐受性。

 

离子/分子流实验处理

1. 0/50 μM CdSO₄处理40 d
2. 0.5 mM原钒酸盐实时处理

 

离子/分子流实验结果

      为了研究Cd的吸收，在菌根和非菌根杨树的根尖测定了Cd²⁺流速。为了找出沿着菌根和非菌根根尖产生最大Cd²⁺流速的位置，在根尖进行了初始测量，随后进行了300 μm距离的测量（图1a）。净Cd²⁺流速沿根尖有较大的变化（图1b）。最大的Cd²⁺内流速率出现在距根尖600 μm处， EMs和Cd胁迫无关（图1b）。菌根根尖的Cd²⁺净内流速率明显高于非菌根（图1b）。此外， 50 μM CdSO₄处理40 d导致净Cd²⁺内流速率减少约30%（图1b）。

 

 

图1. 在无菌根（N）或有菌根（M）Po.×canescens中，0（C）或50 μM CdSO₄（Cd）处理40 d的后外生菌根根尖净Cd²⁺流速变化。正值代表Cd²⁺外排，负值代表Cd²⁺吸收。

 

      为了进一步研究Cd²⁺净流速的时间动态变化以及Cd²⁺净流速和PM H⁺-ATPase之间的耦合，在距灰杨根尖600 μm处发生了最大的Cd²⁺净内流速率，因此对该点的Cd²⁺和H⁺净流速的时间动态进行了详细研究。在原钒酸盐处理之前，在测试期间观察到每个菌根和Cd处理组合的Cd²⁺净流速几乎没有波动（图2a）。与非菌根相比，菌根根尖显示出36~74%的净Cd²⁺内流速率（图2b），而与对照组相比，Cd预处理降低了26~42%的净Cd²⁺内流速率（图2b）。原钒酸盐处理使非菌根的净Cd²⁺内流速率减少82%，甚至导致净Cd²⁺外排，但仅使菌根的净Cd²⁺内流速率减少27%（图2a, b）。在原钒酸盐处理前，无论菌根和Cd处理如何，杨树根中的H⁺净流速都显示出外排（图2c）。菌根的H⁺外排速率也比非菌根强3倍（图2d）。在原钒酸盐处理前，Cd预处理导致根部的H⁺净外排速率高出71~121%（图2d）。原钒酸盐处理抑制了根部的H⁺外排，甚至导致显著的净H⁺内流（图2c, d），表明原钒酸盐是PM H⁺-ATPase的有效抑制剂。

 

 

图2. 0.5 mM原钒酸盐实时处理下的Po.×canescens的Cd²⁺和H⁺流速变化。正值代表H⁺、Cd²⁺外排，负值代表H⁺、Cd²⁺吸收。

 

测试液

0.05 mM CdSO₄, 0.05 mM KCl, 0.25 mM NaCl, 0.15 mM MES, 0.1 mM Na₂SO₄, pH 6.0

 

仪器采购信息

• 据中关村NMT产业联盟了解，陕西地区的西北农林科技大学于2019年采购了美国扬格公司的非损伤微测系统。

• 据中关村NMT产业联盟了解，北京地区的中国林业科学研究院林业研究所于2009年采购了美国扬格公司的非损伤微测系统。

 

 

 

 

 

原文链接：https://doi.org/10.1111/pce.12183

 

关键词：碳水化合物；基因表达；离子流；菌根；营养素；氧化应激；质膜；质子ATP酶；白杨

 

 

 

 

 

 

转自中关村旭月非损伤微测技术产业联盟

 

 

 

 

基本信息

主题：NMT发现胞外ATP通过异源G蛋白、ROS、保卫细胞排Ca²⁺吸H⁺调节气孔开放

期刊：Molecular Plant

影响因子：12.084

研究使用平台：NMT植物免疫创新平台

标题：Extracellular ATP promotes stomatal opening of Arabidopsis thaliana through heterotrimeric G protein α subunit and reactive oxygen species

作者：河北师范大学尚忠林、郝立华、王伟霞、陈忱

 

检测离子/分子指标

Ca²⁺，H⁺

 

检测样品

拟南芥保卫细胞

 

中文摘要（谷歌机翻）

      近年来，三磷酸腺苷（ATP）作为一种信号分子存在于植物细胞的细胞器中。胞外ATP（eATP）在植物生长、发育和胁迫耐受性中起着重要作用。在这里，发现细胞外ATP在光照和黑暗中促进拟南芥的气孔开放。ADP、GTP和弱水解ATP类似物（ATPγS、Bz-ATP和2meATP）表现出类似的效果，而AMP和腺苷不影响气孔运动。乙酰酶抑制气孔开放。ATP促进的气孔开放被NADPH氧化酶抑制剂（diphenylene iodonium）或脱氧剂（dithiothreitol）阻断，在NADPH氧化酶的无效突变体（atrbohD/F）中受损。添加的ATP通过NADPH氧化酶触发保卫细胞中ROS的产生。ATP还诱导保卫胞中Ca²⁺的内流和H⁺的外排。在atrbohD/F中，ATP诱导的离子流速被强烈抑制。在杂合G蛋白α亚基的空突变体中，ATP促进的气孔开放、胞质ROS生成、Ca²⁺流入和H⁺外流均受到抑制。这些结果表明，eATP促进的气孔开放可能涉及异源G蛋白、ROS、胞质Ca²⁺和质膜H⁺-ATPase。

 

离子/分子流实验处理

0.1、0.3、0.6 mM ATP实时处理

 

离子/分子流实验结果

为了证实Ca²⁺参与保卫细胞中的eATP信号传导，使用非损伤微测技术（NMT）检测保卫细胞中的Ca²⁺流速。结果显示，0.6 mM ATP没有显著影响Ca²⁺流速（图1B）。Col-0的保卫细胞Ca²⁺流速在小范围内波动。当添加ATP后，Ca²⁺内流速率在1~2 min后开始增加，在约1 min内达到峰值，然后在随后的3~4 min内恢复到基础水平（图1C）。0.1、0.3、0.6 mM ATP诱导的Ca²⁺内流速率峰值逐渐增加（图1D）。

为了证实H⁺-ATPase在eATP信号传导中的作用，利用NMT研究了ATP对保卫细胞中H⁺外排的影响。作为对照，在样品的测试液中分别加入MES缓冲液、AMP或ATP。结果显示，0.6 mM ATP对H⁺流速没有明显影响（图1F）。在ATP刺激2~3 min后，H⁺外排速率增加，在1 min左右达到峰值，然后在随后的3~4 min内恢复到对照水平（图1G）。0.1、0.3、0.6 mM ATP诱导的H⁺外排速率峰值逐渐增加（图1H）。

 

图1. ATP刺激拟南芥（col-0）保卫细胞的Ca²⁺内流和H⁺外排。正值代表Ca²⁺、H⁺外排，负值代表Ca²⁺、H⁺吸收。

 

为了验证ATP刺激保卫细胞中Ca²⁺内流和H⁺外排的机制，以Gα和NADPH氧化酶的空突变体为植物材料，分别研究0.6 mM ATP对Ca²⁺内流和H⁺外排的影响。在gpa1-1和gpa1-2中，ATP没有促进Ca²⁺流入（图2A）。gpa1-1和gpa1-2的Ca²⁺内流速率峰值远低于野生型（P＜0.05）（图2B）。与col-0中显著的Ca²⁺内流相比，0.6 mM ATP仅能诱导atrbohD/F中微弱的Ca²⁺内流（图2C）。对0.6 mM ATP处理的响应，atrbohD/F中Ca²⁺内流的峰值速度明显低于野生型（P＜0.05）（图2D）。

为了验证异源三聚体（Heterotrimeric）G蛋白和ROS在ATP刺激H⁺外排中的作用，研究了ATP对gpa1-1、gpa1-2和atrbohD/F中H⁺外排影响。两个突变体均未观察到相应野生型ATP刺激的H⁺外排。在gpa1-1和atrbohD/F中，0.6 mM ATP处理后H⁺外排速率仅略有增加（图2E, G）。ATP处理前后的H⁺外排速率峰值进一步证实Gα或NADPH氧化酶功能丧失导致缺乏对ATP的响应（图2F, H）。

 

图2. 异三聚体G蛋白和活性氧物质参与ATP刺激的Ca²⁺内流和H⁺外排。正值代表Ca²⁺、H⁺外排，负值代表Ca²⁺、H⁺吸收。

 

测试液

Ca²⁺：50 mM KCl, 0.1 mM CaCl₂, 10 mM MES, pH 6.1
H⁺：0.1 mM KCl, 0.1 mM CaCl₂, 0.5 mM MES, pH 6.1

 

仪器采购信息

据中关村NMT产业联盟了解，河北地区的沧州市农林科学院于2020年采购了旭月（北京）科技有限公司的非损伤微测系统。

 

 

 

 

原文链接：https://doi.org/10.1093/mp/ssr095

 

关键词：非损伤微测技术；Ca²⁺流；H⁺流；拟南芥；保卫细胞；信号转导

 

 

 

 

转自中关村旭月非损伤微测技术产业联盟

 

 

 

 

基本信息

主题：Ca²⁺流调节植物交叉忍耐的作用机制

期刊：Plant Cell & Environment

影响因子：6.362

研究使用平台：NMT植物免疫创新平台

标题：Plasma membrane Ca²⁺ transporters mediate virus-induced acquired resistance to oxidative stress

作者：塔斯马尼亚大学Sergey Shabala

 

检测离子/分子指标

Ca²⁺，K⁺

 

检测样品

烟草叶肉细胞

 

中文摘要（谷歌机翻）

      本文报道了植物对氧化胁迫的获得性串联现象，并研究了介导这一现象的特定Ca²⁺运输系统的活性。Nicotiana benthamiana植物感染了Potato virus X (PVX)，并暴露于氧化性（紫外线（UV-C）或H₂O₂）胁迫下。通过综合应用一系列电生理（非损伤微测技术）、生化（Ca²⁺-和H⁺-ATPase活性）、成像（细胞内Ca²⁺浓度变化的荧光寿命成像测量）、药理学和细胞学透射电镜技术评估植物的适应性反应。病毒感染的植物有较好的能力控制紫外线诱导的细胞内无Ca²⁺的升高，防止叶绿体的结构和功能损伤。综上所述，本研究结果表明紫外线和病原体诱导的氧化胁迫之间存在高度的串联，并强调了Ca²⁺外排系统在植物获得性抵抗氧化胁迫中的关键作用。

 

离子/分子流实验处理

1. 5 mM H₂O₂ 处理5 min
2. 0.5 mM H₂O₂处理24 h
3. 立即（在1~1.5 min内）在UV-C下暴露
4. UV-C下暴露2 h
5. Ca²⁺渗透通道抑制剂（La3+, 1 μM；Gd3+, 50 μM）和P_2B型ATPase抑制剂（eosin yellow, 0.5 μM；erythrocin, 4 μM）处理1-1.5 h

 

离子/分子流实验结果

      进一步的实验比较了模拟对照和PVX接种的叶肉组织对实时和长期H₂O₂处理的响应。实时5 mM H₂O₂处理引起了烟草叶肉细胞大量的净Ca²⁺吸收（图1a）。模拟对照组的Ca²⁺内流速率的峰值是PVX接种部分的两倍（P＜0.05）。同时，急性H₂O₂胁迫也引起了叶肉细胞明显的K⁺流出（图1b）。与PVX接种的样品相比，模拟对照组的外排速率显著更高（P＜0.05）。对于长时间的氧化应激处理（0.5 mM H₂O₂ 24 h）也获得了相似的结果。接种PVX的叶片正在积极地泵出Ca²⁺（净外排），而模拟对照仍显示Ca²⁺内流。细胞中K⁺的“泄漏”在被PVX接种的叶片中也有很大的衰减（在P＜0.05处显著）（图1c）。

 

图1. 马铃薯X病毒（PVX）接种后叶片氧化应激耐受性增强的证据。正值表示Ca²⁺和K⁺吸收，负值表示Ca²⁺和K⁺外排。

 

      为了区分Ca²⁺是跨膜内流还是外排的，使用非损伤微测技术对净Ca²⁺流速进行了检测。在UV胁迫后立即进行测量，20 min的UV-C处理导致烟草叶片叶肉细胞净Ca²⁺内流速率急剧增加（图2a中的灰色圆圈），特别是在光照条件下。但在2 h后， Ca²⁺净外排速率显著降低（P＜0.01）（图2a中的灰色三角形）。对照组和PVX接种的叶片之间的Ca²⁺外排的动态变化有显著的不同。PVX接种的叶片在UV处理停止后几分钟内恢复到净Ca²⁺外排，而对于未接种的对照组，从净Ca²⁺内流切换到Ca²⁺外排需要更长的时间（约15 min）（图2b）。

 

图2. UVC处理后烟草叶肉细胞的净Ca²⁺流速的时间依赖性和UV-C处理20 min后叶片的Ca²⁺流速的变化。正值表示Ca²⁺吸收，负值表示Ca²⁺外排。

 

      应用La³⁺和Gd³⁺这两种已知的Ca²⁺渗透通道抑制剂，无论是在黑暗中还是在光照条件下，都导致Ca²⁺净外排的显著转变（图3）。这进一步表明，在正常情况下，通道介导的Ca²⁺吸收是由一些基于质膜的Ca²⁺外排系统的活性所平衡的，这些抑制剂中的任何一种都对烟草中叶段的净Ca²⁺流速的大小没有显著的影响（P＜0.05）（图3）。这表明，在氧化胁迫条件下，质膜Ca²⁺-ATPase在介导Ca²⁺外排方面发挥的作用有限。

 

图3. Ca²⁺渗透通道抑制剂（La³⁺, 1 μM；Gd³⁺, 50 μM）和P_2B型ATPase抑制剂（eosin yellow, 0.5 μM；erythrocin, 4 μM）对烟草叶肉细胞净Ca²⁺流速的影响。正值表示Ca²⁺吸收，负值表示Ca²⁺外排。

 

测试液

0.1 mM CaCl₂, 0.2 mM KCl, pH 5.5

 

文章简介

      植物经历了某种逆境后，能提高对另一种逆境的抵抗能力，这种对不良环境之间的相互忍耐作用称为交叉忍耐（Cross-tolerance）。例如UV处理烟草提高了对花叶病毒的忍耐，臭氧处理拟南芥引起了对Pseudomonas syringae病毒的抵抗力。在这些研究中，诱导的交叉忍耐主要由ROS产生，与氧化爆发期间快速释放H₂O₂，以及与植物对无毒的病原反应有关。ROS可能作为信使激活防御基因的表达，但是在这个过程中Ca²⁺信号转导的作用不清楚。
      2011年2月，澳大利亚的Shabala等人报道了对植物氧化胁迫获得性的交叉忍耐现象，研究了Ca²⁺转运系统的活性如何调节这种现象。烟草感染了马铃薯病毒X（Potato virus X, PVX），暴露在氧化胁迫（UV-C或者H₂O₂）中，用非损伤微测技术测定了Ca²⁺和K⁺流速，结合药理学和细胞学方法研究了植物整体的适应性反应，发现植物受病毒感染后能够更好地应对UV和H₂O₂，阻止叶绿体结构和功能的损伤。Ca²⁺流是植物对病原入侵的早期反应，Ca²⁺的传递和ROS可能是控制细胞水平交叉忍耐的关键。
      这项研究说明在UV和病原诱导的氧化胁迫之间有一个高度的交叉，以及在植物对氧化胁迫获得性的忍耐中Ca²⁺外流系统的重要作用，重新提出了病毒可能有益于植物抗逆的争论。在大田中，不同的胁迫一起出现很常见，病毒增加胁迫忍耐可能对农业的发展有重要意义

 

 

 

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-3040.2010.02251.x

 

关键词：非损伤微测技术；Ca²⁺/H⁺交换体；Ca²⁺泵；叶绿体； 叶肉；马铃薯病毒X；紫外线辐射