转自中关村旭月非损伤微测技术产业联盟

 

 

 

 

 

基本信息

主题：NMT发现NO促Pb吸收并诱导Ca²⁺流紊乱 为NO增强Pb毒性的机制研究提供证据

期刊：Plants

影响因子：2.632（2019年）

研究使用平台：NMT重金属创新平台

标题：Nitric Oxide Enhances Cytotoxicity of Lead by Modulating the Generation of Reactive Oxygen Species and Is Involved in the Regulation of Pb²⁺ and Ca²⁺ Fluxes in Tobacco BY-2 Cells

作者：北京林业大学荆艳萍、武佳叶、张越

 

检测离子/分子指标

Pb²⁺、Ca²⁺

 

检测样品

4日龄BY-2细胞

 

中文摘要（谷歌机翻）

      铅是已知对动植物都有毒害作用的重金属。据报道，一氧化氮（NO）参与植物对不同重金属胁迫的响应。本研究分析了外源和内源NO在铅诱导烟草BY-2细胞毒性中的作用，使用非损伤微测技术（NMT）重点研究了NO在活性氧（ROS）生成以及Pb²⁺和Ca²⁺流速中的作用。Pb处理诱导BY-2细胞死亡并迅速产生NO和ROS，而NO爆发发生早于ROS积累。2-4-carboxyphenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide（cPTIO）消除NO导致ROS减少，硝普钠（SNP）补充NO导致ROS积累增加。此外，外源NO的加入刺激了Pb²⁺的内流，从而促进了细胞对Pb的吸收，加重了Pb对细胞的毒性，而去除内源性NO则产生了相反的作用。此外，研究还发现，外源性和内源性NO均增强Pb诱导的Ca²⁺外排和钙稳态紊乱。这些结果表明，外源和内源性NO通过促进Pb²⁺的内流和积累，干扰钙稳态，在Pb胁迫诱导的BY-2细胞死亡中发挥重要的调节作用。

 

离子/分子流实验处理

1、250 μM Pb(NO₃)₂处理BY-2细胞10 h

2、250 μM Pb(NO₃)₂+0.5 μM SNP处理BY-2细胞10 h

3、250 μM Pb(NO₃)₂+100 μM cPTIO处理BY-2细胞10 h

4、0.5 μM SNP、100 μM cPTIO实时处理

 

离子/分子流实验结果

      本研究用250 μM Pb (NO₃)₂处理4日龄烟草BY-2细胞，立即用NMT测定Pb²⁺流速。250 μM Pb (NO₃)₂处理后，Pb²⁺内流速率恒定，平均值为70.40±2.70 pmol cm^-2·s^-1（图1A）。添加0.5 μM SNP后，Pb²⁺内流显著增加，达到160.56±32.83 pmol cm^-2·s^-1，显著增加128.06%。与单独Pb处理相比，100 μM cPTIO处理显著抑制了Pb²⁺的内流，甚至出现6.75±0.85 pmol cm^-2·s^-1的Pb²⁺净外排（图1A, B）。这些结果表明，在短时间内，SNP或cPTIO的存在显著改变了Pb (NO₃)₂处理下的的Pb²⁺流速。

 

图1. Pb胁迫下施用SNP和cPTIO前后NO对烟草BY-2细胞Pb²⁺流速的影响。正值代表Pb²⁺外排，负值代表Pb²⁺内流。

 

      研究还测定了长期不同处理的细胞中Pb²⁺流速。如图2所示，单独Pb处理10 h时，烟草BY-2细胞内有Pb²⁺内流，其平均内流速率为34.94±2.98 pmol cm^-2·s^-1。添加SNP后，Pb²⁺平均流速显著增加，达到88.98±10.38 pmol cm^-2·s^-1。SNP存在时Pb²⁺流速的平均值约为单独Pb处理的2.55倍。然而， cPTIO处理下的细胞Pb²⁺外排速率最小，平均值为0.37±2.83 pmol cm^-2·s^-1。上述结果表明，NO增强了Pb²⁺向细胞内流入。

 

图2. 不同处理10 h后NO对烟草BY-2细胞中Pb²⁺流速的影响。正值代表Pb²⁺外排，负值代表Pb²⁺内流。

 

      钙作为营养和信号分子，在植物的各种生命活动中发挥着重要作用。在这项工作中，NO促进了Pb²⁺的流入并参与了BY-2悬浮细胞对Pb的吸收。我们进一步检测了NO对Pb诱导的Ca²⁺流速变化的影响。如图3所示，对照细胞检测到Ca²⁺流入烟草BY-2细胞，其平均值为13.54±2.78 pmol cm^-2·s^-1。Pb胁迫下，Ca²⁺内流受到抑制，由内流转变为外排，平均值为17.88±1.33 pmol cm^-2·s^-1。0.5 μM SNP处理的烟草BY-2细胞Ca²⁺外排速率（29.42±4.97 pmol cm^-2·s^-1）显著高于单独Pb处理的细胞。在100 μM cPTIO存在下，Ca²⁺的外排速率比单独Pb处理降低了13.18±0.91 pmol cm^-2·s^-1。然而，这种影响并不显著。这些数据显示NO增强了Pb诱导烟草BY-2细胞钙稳态紊乱。

 

图3. 不同处理10 h后NO对烟草BY-2细胞中Ca²⁺流速的影响。正值代表Ca²⁺外排，负值代表Ca²⁺内流。

 

结论

      如图4所示，Pb胁迫诱导了Pb²⁺的内流以及ROS和NO的产生。Pb胁迫诱导的外源和内源NO作用于ROS上游，促进烟草BY-2细胞内ROS的积累和随后的细胞死亡。外源NO和内源NO均能增强烟草BY-2细胞对Pb的毒性，其机制可能与NO能刺激Pb²⁺内流，从而促进Pb的吸收，加重Pb诱导的BY-2细胞Ca²⁺稳态失调有关。这些发现会使大家对植物细胞中NO潜在的Pb细胞毒性机制有了更好的认识。

 

图4. NO通过调节ROS的产生，促进Pb²⁺向细胞内流，影响Ca²⁺稳态，增强Pb的细胞毒性作用示意图。 

 

测试液

Pb²⁺：0.1 mM KCl, 0.05 mM CaCl₂, 0.05mM MgCl₂, 0.5 mM NaCl, 0.25 mM Pb(NO₃)₂, 0.3 mM MES, 3% sucrose, pH 5.8

Ca²⁺：0.1 mM KCl, 0.05 mM CaCl₂, 0.05 mM MgCl₂, 0.5 mM NaCl, 0.3 mM MES, 3% sucrose, pH 5.8

 

仪器采购信息

据中关村NMT产业联盟了解，北京地区的北京林业大学于2009年采购了美国扬格公司的非损伤微测系统

 

 

 

原文链接：https://doi.org/10.3390/plants8100403

 

关键词：NO；Pb²⁺；流速；稳态；Ca²⁺；烟草BY-2细胞

 

 

 

 

 

 

转自中关村旭月非损伤微测技术产业联盟

 

 

 

感谢本文通讯作者，中国林科院国家林业和草原局盐碱地研究中心杨秀艳副研究员校稿

 

 

基本信息

主题：NMT发现白刺通过维持叶肉排Na⁺保K⁺能力及H⁺泵活性来适应盐胁迫

期刊：Tree Physiology

影响因子：3.655（2020年）

研究使用平台：NMT植物耐盐创新平台

标题：Tissue tolerance mechanisms conferring salinity tolerance in a halophytic perennial species Nitraria sibirica Pall.

作者：中国林科院国家林业和草原局盐碱地研究中心张华新、杨秀艳、唐晓倩、张会龙

 

检测离子/分子指标

K⁺、Na⁺、H⁺

 

检测样品

西伯利亚白刺叶肉组织

 

中文摘要（谷歌机翻）

      植物的耐盐性依赖于不同组织和器官的协调运转。组织耐盐性是赋予植物适应盐环境的关键性状之一。这一特性意味着在代谢活跃的细胞中能够维持较低的胞质Na⁺/K⁺比值。本研究以多年生木本盐生植物西伯利亚白刺（Nitraria sibirica）为材料，探讨其耐盐性机制。结果表明，100~200 mM NaCl处理刺激了幼苗的生长。离子分布结果表明，叶片起到Na⁺库的作用，而植物根系具有优越的保K⁺能力。从土壤中吸收的过量Na⁺主要转运到地上部分，最终被区隔在叶肉细胞的液泡中。因此，在盐胁迫下西伯利亚白刺能够在组织和细胞水平上特异性保持K⁺/Na⁺的最适平衡。为此，西伯利亚白刺叶肉细胞中液泡H⁺-ATPase和H⁺-PPase酶活性升高， NsVHA、NsVP1和NsNHX1基因的表达上调。NsVHA、NsVP1和NsNHX1介导的叶肉液泡Na⁺区隔化降低了细胞质中Na⁺浓度，抑制了K⁺的流失。同时，西伯利亚白刺在转录水平上调TPK的表达，促进K⁺从液泡向细胞质转移，有助于维持细胞质中K⁺稳态。综上表明，西伯利亚白刺的液泡Na⁺区隔化和细胞内K⁺稳态等组织耐受特性对西伯利亚白刺适应土壤盐渍化具有重要作用。

 

离子/分子流实验处理

0、200和400 mM NaCl处理24 h

 

离子/分子流实验结果

      采用非损伤微测技术（NMT）检测了西伯利亚白刺叶肉细胞Na⁺、K⁺和H⁺的稳定流速。盐胁迫诱导叶肉Na⁺和K⁺净外排速率呈剂量依赖性增加（图1A-D）。同时，盐处理导致H⁺净外排速率呈剂量依赖性增加（图1E, F），可作为PM H⁺-ATPase活性的一个体现。

 

图1. 西伯利亚白刺幼苗叶片叶肉细胞内Na⁺、K⁺和H⁺的净流速。。正值代表Na⁺、K⁺和H⁺外排，负值代表Na⁺、K⁺和H⁺吸收。

 

其他实验结果

• NaCl浓度在100~200 mM时对西伯利亚白刺幼苗的生长有刺激作用，超过300 mM时则产生抑制作用。

• NaCl处理后西伯利亚白刺幼苗叶片、茎和根中的Na⁺含量以剂量依赖性方式增加；随着NaCl浓度的增加，叶中K⁺含量下降，但根中K⁺含量有所增加；随着胁迫严重程度和时间的增加，幼苗3个组织的K⁺/Na⁺比值均有所下降。各处理下，根部的K⁺/Na⁺比最高，叶片最低。

• 盐处理诱导了叶肉细胞Na⁺积累。

• NaCl胁迫显著提高了液泡膜H⁺-ATPase和H⁺-PPase的活性，且活性呈时间依赖性增加。各时间点PM H⁺-ATPase活性均低于液泡膜H⁺-ATPase活性。

• 采用RT-qPCR测定了6个参与Na⁺和K⁺运输的基因表达。盐胁迫显著增加了大部分目标基因的表达，在400 mM NaCl胁迫1 d后或200 mM NaCl胁迫14 d后，检测到的基因表达量最高，表明它们可能参与了液泡Na⁺区隔化和K⁺保留的过程。

 

结论

      本研究表明，西伯利亚白刺的耐盐性主要表现在液泡Na⁺区隔化和细胞质K⁺稳态。未来的研究应侧重于其他细胞器（如内质网）作为细胞内Na⁺储存的潜在储存体的作用。同时，液泡含有水解酶、磷酸酶和磷酸酯酶等多种酶类，因而与泛素化等蛋白质修饰过程相联系。在液泡液中Na含量较高的情况下，液泡中的酶如何发挥作用还有待回答。

 

测试液

0.1 mM KCl, 0.1 mM NaCl, 0.1 mM CaCl₂, 0.3 mM MES, pH 5.7

 

仪器采购信息

据中关村NMT产业联盟了解，北京地区的中国林科院于2009年采购了美国扬格公司的非损伤微测系统。

 

 

 

原文链接：https://doi.org/10.1093/treephys/tpaa174

 

关键词：K⁺/Na⁺稳态；Na⁺储存；盐胁迫；组织特异性离子分布

 

 

 

 

 

 

转自中关村旭月非损伤微测技术产业联盟

 

 

 

 

基本信息

主题：NMT发现Ca²⁺流在H₂S调控ABA信号通路研究中充当关键生理证据

期刊：Molecular Plant

影响因子：10.812（2019年）

研究使用平台：NMT水旱胁迫创新平台

标题：Hydrogen Sulfide Positively Regulates Abscisic Acid Signaling through Persulfidation of SnRK2.6 in Guard Cells

作者：西北农林科技大学李积胜、陈思思、王晓峰，陕西科技大学贾红磊

 

检测离子/分子指标

Ca²⁺

 

检测样品

拟南芥保卫细胞

 

中文摘要（谷歌机翻）

      植物激素脱落酸（ABA）在触发气孔关闭和提高植物对干旱胁迫的适应性方面起着关键作用。硫化氢（H₂S）是一种气体信号分子，参与ABA依赖性气孔关闭。然而，H₂S如何调控ABA信号转导仍不清楚。研究表明，ABA诱导DES1在保卫细胞中催化H₂S的产生，而H₂S则通过OST1/SnRK2的硫巯基化（persulfidation）来正向调节ABA信号传导。暴露在SnRK2.6表面并靠近激活环的两个半胱氨酸位点（Cys131和Cys137）被硫巯基化，从而促进SnRK2.6的活性以及和ABF2（ABA信号下游的转录因子）的相互作用。当SnRK2.6中的Cys131、Cys137或两者都被丝氨酸取代时，H₂S诱导的SnRK2.6活性和SnRK2.6-ABF2相互作用部分(SnRK2.6^C131Sand SnRK2.6^C137S)或完全(SnRK2.6^C131SC137S)组成。在ost1-3突变体中引入SnRK2.6^C131S、SnRK2.6^C137S、或SnRK2.6^C131SC137S不能改变突变体的表型，它们对ABA和H₂S诱导的气孔关闭和Ca²⁺内流不敏感，导致失水增加和抗旱能力下降。综上所述，本研究揭示了一种新的ABA信号转导的翻译后调控机制，其中H₂S硫巯基化SnRK2.6促进ABA信号转导和ABA诱导的气孔关闭。

 

离子/分子流实验处理

5周龄拟南芥幼苗，10 μM ABA/100 μM NaHS实时处理。

 

离子/分子流实验结果

      Ca²⁺信号是气孔运动的重要调节因子，并在SnRK2.6的下游调节ABA依赖性气孔闭合。因此，本研究分析了保卫细胞的瞬时Ca²⁺流速。如图1A所示，施加10 μM ABA会引起WT保卫细胞中显著的Ca²⁺跨膜内流，在ABA处理后20 s到40 s出现Ca²⁺内流高峰，然后迅速恢复到稳态。在ost1-3保卫细胞中，ABA不会显著影响Ca²⁺的流速（图1B）。ost1-3/2.6^WT完全补充了ABA诱导的ost1-3的Ca²⁺内流（图1C）。但是，ost1-3/2.6^C131S，ost1-3/2.6^C137S和ost1-3/2.6^C131SC137S对ABA诱导的Ca²⁺内流的敏感性降低了（图1D-F）。此外，des1对ABA诱导的Ca²⁺内流的敏感性也降低了（图1G）。通过计算Ca²⁺内流速率的平均值发现，WT和ost1-3/2.6^WT的值最大，并且在des1、ost1-3/2.6^C131S、ost1-3/2.6^C137S和ost1-3/2.6^C131SC137S中的值依次降低（图1H）。NaHS处理还引起WT保卫细胞的瞬时Ca²⁺内流（图1I）。NaHS诱导的Ca²⁺内流峰值比ABA诱导的内流峰值弱，但持续时间更长（图1I-P）。ost1-3和ost1-3/2.6^C131SC137S对NaHS不敏感（图1J, N, P）。ost1-3/2.6^WT补充了NaHS诱导的ost1-3的Ca²⁺流入（图1K）。ost1-3/2.6^C131S，ost1-3/2.6^C137S和des1，对NaHS诱导的Ca²⁺内流的敏感性降低（图1L, M, O）。

 

图1. 保卫细胞Ca²⁺净流速测定。负值代表Ca²⁺吸收。

 

测试液

0.1 mM KCl, 0.1 mM CaCl₂, 0.3 mM MES, 0.2 mM Na₂SO₄, pH 6.0

 

仪器采购信息

• 据中关村NMT产业联盟了解，陕西地区的西北农林科技大学于2019年采购了美国扬格公司的非损伤微测系统

• 据中关村NMT产业联盟了解，陕西地区的陕西科技大学于2019年采购了旭月（北京）科技有限公司的非损伤微测系统。

 

 

 

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.molp.2020.01.004

 

关键词：非损伤微测技术；Ca²⁺流；拟南芥；植物生长发育

 

 

 

 

 

 

转自中关村旭月非损伤微测技术产业联盟

 

 

 

 

基本信息

主题：NMT发现干旱下寸草叶肉吸收K⁺/Cl^-/Na⁺速率增加证明其通过提升渗透调节力抵御干旱

期刊：Plants

影响因子：2.762（2020年）

研究使用平台：NMT干旱胁迫创新平台

标题：Antioxidant Enzymatic Activity and Osmotic Adjustment as Components of the Drought Tolerance Mechanism in Carex duriuscula

作者：Sergey Shabala（塔斯马尼亚大学）、陈立平（北京市农林科学院）、侯佩臣（北京市农林科学院、塔斯马尼亚大学）、Feifei Wang（扬州大学）、罗斌（北京市农林科学院）

 

检测离子/分子指标

K⁺、Cl^-、Na⁺

 

检测样品

寸草根分生区（距根尖100 μm根表上的点）

 

中文摘要（谷歌机翻）

      干旱胁迫是植物生长的一个主要环境制约因素。气候变化导致的环境温度升高导致降雨量减少或分布不均，会加剧土壤干旱程度。寸草（Carex duriuscula）是一种典型的耐旱莎草，但很少有报道研究其耐旱机制。本研究通过测定寸草叶片和根系组织的抗氧化酶活性，评价有机和无机渗透调节物质在植物渗透调节中的作用，并将其与根系离子吸收方式联系起来，了解寸草的干旱响应机制。采用2个水平的胁迫：轻度（MD）和重度（SD）干旱处理，随后复水。干旱胁迫导致叶片相对含水量和叶绿素含量降低；同时，叶片和根系中过氧化氢（H₂O₂）和超氧阴离子（O₂^-）的含量增加。MD胁迫下，叶片过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活性增加，而根中只有CAT和POD活性增加。SD胁迫导致根和叶的CAT、POD、超氧化物歧化酶（SOD）、GPX活性均升高。叶片中脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量也增加。在MD和SD两种胁迫条件下，寸草增加了根系对K⁺、Na⁺和Cl^-的吸收，导致叶片和根系中K⁺、Na⁺和Cl^-浓度升高。这种对无机渗透剂的依赖使寸草的渗透调节具有成本效益。总体而言，这项研究表明，由于其 ROS 清除系统和渗透调节机制的有效运行，寸草能够在干旱环境中生存。

 

离子/分子流实验处理

40 mM（MD）或70 mM甘露醇实时处理

 

离子/分子流实验结果

      为了解释干旱胁迫引起的组织离子浓度变化的机制，研究检测了高渗胁迫下根部Na⁺、K⁺和Cl^-吸收转运情况。通过向培养皿中加入适量的甘露醇（最终浓度分别为40和70 mM）来模拟MD和SD条件。如图1所示，甘露醇处理导致所有检测的离子吸收迅速增加（在几分钟内），并在40~45 min内达到稳定。这种增加是剂量依赖性的（例如，更高浓度的甘露醇会产生更高的刺激）。

 

图1. 在（40mM甘露醇）和SD（70 mM甘露醇）渗透胁迫下，检测寸草根分生区的净离子流速。(A）K⁺流速，（B）Na⁺流速，（C）Cl^-流速。负值代表K⁺、Cl^-、Na⁺吸收。

 

Sergey Shabala课题组NMT成果回顾

·联盟澳洲专家S Shabala：HKT1;5通过调节Na+/K+稳态传递Ca2+信号促植物耐盐

 

·S Shabala、陈仲华：NMT发现盐胁迫下耐盐水稻叶肉细胞排K+排Cl-更低

 

·EEB联盟澳洲专家：NMT发现氢气提高根Na-H转运体活性与保钾能力促大麦耐盐

 

·IJMS联盟澳洲专家：HKT1;5通过调节植物钠钾钙离子稳态响应盐胁迫

 

测试液

0.1 mM KCl, 0.1 mM CaCl₂, 0.1 mM MgCl₂, 0.5 mM NaCl, 0.2 mM Na₂SO₄, 0.3 mM MES, pH 6.0

 

仪器采购信息

• 据中关村NMT产业联盟了解，江苏地区的扬州大学于2016年采购了旭月（北京）科技有限公司的非损伤微测系统。

• 据中关村NMT产业联盟了解，北京地区的北京大学、中国农业大学、中国科学院植物研究所等数十家单位采购了旭月（北京）科技有限公司的非损伤微测系统。

 

 

 

 

原文链接：https://doi.org/10.3390/plants10030436

 

关键词：寸草；干旱耐受；ROS；抗氧化酶；离子浓度；渗透调节；能量消耗