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旭月NMT简报---关键词搜索：

Front Cell Dev Biol：NMT发现葡萄糖可诱导i-β细胞Ca浓度增加释放胰岛素是糖尿病治疗的潜在胰岛β细胞来源

转自中关村旭月非损伤微测技术产业联盟

 

 

 

 

基本信息

主题：NMT发现葡萄糖可诱导i-β细胞Ca浓度增加释放胰岛素是糖尿病治疗的潜在胰岛β细胞来源

期刊：Frontiers in Cell and Developmental Biology

影响因子：5.201

研究使用平台：NMT代谢疾病研究创新平台

标题：miR-212/132-Enriched Extracellular Vesicles Promote Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells Into Pancreatic Beta Cells

通讯作者：高玉花（济宁医学院、中国农业科学院北京畜牧兽医研究所）、关伟军（中国农业科学院北京畜牧兽医研究所）、李向臣（浙江农林大学）

第一作者：白春雨（济宁医学院、中国农业科学院北京畜牧兽医研究所）

 

检测离子/分子指标

Ca2+

 

检测样品

人类β细胞、多能干细胞（iPSCs）、iPSCs分化β细胞（i-Beta cells）

 

中文摘要（谷歌机翻）

      胰岛β细胞移植是治疗1型糖尿病（T1DM）的理想方法，从患者身上诱导多能干细胞（iPSCs）中产生β细胞是一种很有前景的策略。本研究改进了以往的策略，利用成熟β细胞的细胞外囊泡（EVs）和iPSCs分化β细胞（i-Beta cells）生产β细胞，在体外葡萄糖刺激下分泌胰岛素，并改善体内的高血糖症。机制分析显示，EV携带的microRNA(miR)-212/132(EV-miR-212/132)直接与FBW7的30UTR结合以阻止其翻译，FBW7与NGN3结合以加速其蛋白体降解。EV-miR-2120/132稳定NGN3表达，促进诱导iPSCs向内分泌细胞分化。此外，NGN3与PDX1结合，增强内源性miR-212/132的转录，形成维持成熟胰岛β细胞功能的正调控回路。

 

离子/分子流实验处理方法

20 mM葡萄糖实时处理

 

离子/分子流实验结果

      利用非损伤微测技术（NMT）检测Ca2+内流速率。检测前将i-β细胞接种于35 mm培养皿中，用含2 mM葡萄糖的测试液灌流，然后加入高浓度葡萄糖（20 mM）。结果表明，20 mM葡萄糖显著提高i- β细胞内Ca2+浓度。相反，iPSCs表现出钙响应异常（图1）。

 

图1. 人类β细胞、i-β细胞和iPSCs中的Ca2+流速。(A-C)通过NMT检测的人类β细胞、i-β细胞和iPSCs的图像。(D-F)葡萄糖实时处理诱导人类β细胞、i-β细胞和iPSCs的Ca2+流速模式。在加入20 mM葡萄糖后，人β细胞和i-β细胞观察到了Ca2+的内流，而iPSCs则没有。

 

 

其它实验结果

  • EVs有效地将其生物分子传递给iPSCs并协助分化为i-β细胞。

  • 用2和20 mM葡萄糖处理时，i-β细胞释放胰岛素，而iPSCs在体外不释放胰岛素。

  • 通过透射电镜检测胰岛素颗粒，并分析人β细胞和i-β细胞中每个细胞胰岛素颗粒的数量。在i-β细胞和人β细胞中观察到发育的胰岛素颗粒和成熟的、结晶的胰岛素颗粒，平均每个细胞胰岛素颗粒分别为58±9个和68±12个。

  • 利用共聚焦光学系统实时监测i-β细胞和Fluo-4AM标记的iPSCs钙内流。Ca2+的荧光值显示，i-β细胞和人类β细胞通过增加细胞内Ca2+对葡萄糖的连续刺激产生响应。

  • 为了证明EVs在i-β细胞分化中的作用，通过qPCR检测不同阶段转录因子的mRNA水平， 从第三阶段开始，NGN3的mRNA水平急剧升高，在7天和14天的第四阶段没有观察到明显的变化，但蛋白质水平明显增加，这意味着翻译后修饰调节NGN3的稳定性。

  • EV携带的miRNAs中，明显富集的前五个miRNAs（miR-21-5p、miR-29a-3p、miR-7b-5p、Let-7f和miR-212-3p/132-3p）在以前的研究中被报道参与了胰岛β细胞的发育和维持其功能。将这5种miRNAs的抑制剂应用于i-β细胞与EVs结合。通过流式细胞仪检测胰岛素阳性细胞，这表明这5个miRNAs参与了i-β细胞的形成，但加入miR-212-3p和miR-132-3p抑制剂后，阳性细胞明显减少。

  • EV-miR-212/132通过靶向30UTR的种子序列直接抑制FBW7的翻译。

  • 在EV-miR-212/132介导的Fbw7损失后，神经元素3（Neurogenin3, Ngn3）的稳定有助于分化程序，诱导iPSCs分化为i-Beta细胞。

  • EV携带的miR-212/132稳定了NGN3的表达，使其与PDX1结合，并通过形成调控回路增强miR-212/132的转录。

  • 移植i-β细胞和人β细胞后，小鼠肾脏附近存在胰岛样结构，而iPSCs不存在。

  • i-β细胞与正常人的β细胞或其他干细胞衍生的β细胞类似，能够分泌胰岛素并迅速改善糖尿病小鼠的高血糖。

 

 

结论

      本研究改进了利用miR-212/132富集的细胞外囊泡从iPSCs分化β细胞的策略，阐明了miR-212/132在此过程中靶向FBW7稳定NGN3表达的重要作用。此外，NGN3与PDX1结合，增强内源性miR-212/132的转录，形成维持成熟胰岛β细胞功能的正调控电路（图2）。本研究为iPSCs体外培养胰岛β细胞提供了新策略，并为1型糖尿病移植治疗提供了潜在的胰岛β细胞来源。

 

 

 

测试液

0.1 mM CaCl2, 0.5 mM KCl, 137 mM NaCl, 0.1mM NaHCO3, 0.1 mM KH2PO4, 0.1 mM Na2HPO4, 5.6 mM葡萄糖, pH7.2

 

仪器采购信息

  • 据中关村NMT产业联盟了解，北京地区的北京大学于2019年采购了美国扬格公司的非损伤微测系统。

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    据中关村NMT产业联盟了解，山东地区的中国科学院烟台海岸带研究所于2020年采购了美国扬格公司的非损伤微测系统。

  •  

    据中关村NMT产业联盟了解，浙江地区的中国林业科学研究院亚热带林业研究所于2014年采购了旭月公司的非损伤微测系统。

 

 

原文链接：https://doi.org/10.3389/fcell.2021.673231

 

关键词：iPSCs；β细胞；分化；细胞外囊泡；miRNAs

 

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