农科院区划所程宪国：NMT发现亚精胺促盐碱胁迫下种子耗O2及Ca2+、H2O2积累揭示亚精胺影响种子渗透调节的途径

转自中关村旭月非损伤微测技术产业联盟

基本信息

主题：NMT发现亚精胺促盐碱胁迫下种子耗O₂及Ca²⁺、H₂O₂积累揭示亚精胺影响种子渗透调节的途径

期刊：Frontiers in Plant Science

影响因子：5.753

研究使用平台：NMT植物耐盐创新平台

标题：Exogenous Spermidine Priming Mitigates the Osmotic Damage in Germinating Seeds of Leymus chinensis Under Salt-Alkali Stress

作者：中国农业科学院农业资源与农业区划研究所程宪国、陈红娜

检测离子/分子指标

O₂、H₂O₂、Ca²⁺

检测样品

种子胚顶部和种子胚乳1/2处

中文摘要

众所周知，亚精胺（Spd）是保护参与植物生理生化过程的大分子物质。然而，Spd也可能在盐碱胁迫下对羊草（Leymus chinensis）种子萌发起渗透调节作用。为了进一步研究这一点，将羊草种子用Spd溶液或蒸馏水浸泡，将浸泡后的种子播种于盐碱土中进行培养试验。有资料表明，Spd引发使萌发种子可溶性糖含量增加50%以上，脯氨酸含量增加30%以上。此外，Spd引发使萌发种子过氧化氢酶活性增加30%以上，过氧化物酶活性增加25%以上，有效缓解了盐碱胁迫下萌发种子质膜的氧化损伤。此外，种子的Spd引发影响盐碱胁迫下萌发种子中多胺（PA）的积累，维持参与生理代谢的大分子物质的活性。此外，Spd引发处理使萌发种子的过氧化氢（H₂O₂）水平提高到30%以上，Ca²⁺浓度提高到20%以上，从而通过有益的激素富集打破了羊草种子的休眠诱导途径。本研究揭示了外源性Spd引发羊草种子过程中Spd介导的调控途径，该途径可减轻渗透性和氧化性损伤，维持细胞脂膜的完整性。因此，外源Spd启动提高了PA氧化酶活性，维持了H₂O₂的积累。研究发现，H₂O₂对Ca²⁺和激素的平衡产生了有益的影响，促进了羊草在应对盐碱胁迫时的活力和萌发。

离子/分子流实验处理方法

①0/1 mM Spd溶液中浸泡12 h，盐碱土培养3 d后的羊草种子。

②1 mM Spd溶液中浸泡12 h，盐碱土培养3 d后的羊草种子，蒸馏水、1 mM DPI、1 mM KI室温浸泡3h。

离子/分子流实验结果

前期研究表明，种子活力与氧气内流量显著相关。因此研究用非损伤微测技术（NMT）检测了羊草种子中的氧气内流速率。结果表明，在盐碱胁迫条件下，亚精胺处理后种子中的氧气内流速率显著提高，约为对照种子的五倍（图1）。

图1. 盐碱胁迫条件下，外源亚精胺对羊草种子O₂净流速的影响。负值表示离子吸收。

为了进一步表征亚精胺对种子胚部位H₂O₂和Ca²⁺积累的影响，用NMT检测了种子胚乳中部和种子胚顶部的H₂O₂和Ca²⁺的流速。与对照种子不同，亚精胺预处理的种子表现出显著的H₂O₂内流，并且亚精胺预处理后种子胚中的H₂O₂净内流速率显著高于种子胚乳中的净内流速率。此外，两种处理均表现出明显的Ca²⁺外排，而亚精胺处理后种子中Ca²⁺的整体外排速率显著低于对照，亚精胺处理后种子胚中Ca²⁺的外排速率显著低于种子胚乳（图2）。

图2. 盐碱胁迫条件下，外源亚精胺对羊草种子胚和胚乳H₂O₂和Ca²⁺净流速的影响。正值代表离子/分子外排，负值表示离子/分子吸收。

此外，种子胚中Ca²⁺浓度的空间成像结果表明，暴露于水微环境的种子中Ca²⁺浓度梯度不明显，而种子表面附近的Ca²⁺浓度略高于水环境中的Ca²⁺浓度。但DPI或KI处理后种子微环境中Ca²⁺梯度较大，且种子表面附近Ca²⁺浓度也显著高于水环境中Ca²⁺浓度，暗示着DPI和KI处理中Ca²⁺外排速率显著提高（图3）。

图3. 盐碱胁迫条件下，外源DPI或KI对羊草种子表明Ca²⁺浓度梯度的影响。

其他实验结果

亚精胺改善羊草种子的萌发前代谢。结果表明，与对照种子相比，亚精胺预处理的种子内源亚精胺含量增加了51.63%，内源精胺增加了23.73%，PAO酶活性增加了49.84%。同时，H₂O₂含量增加了36.65%；此外，CAT和POD的酶活性分别增加了32.18%和26.37%；与对照种子相比，亚精胺预处理的种子可溶性糖含量增加53.94%，脯氨酸含量增加30.72%，电导率降低11.39%；此外，亚精胺预处理的种子Ca²⁺和K⁺含量没有增加，但细胞质中Ca²⁺和K⁺的荧光强度显着增强；外源亚精胺显着降低了种子ABA的积累，并降低了ABA与GA₃的比例。
亚精胺促进羊草种子萌发和活力。与对照种子相比，亚精胺预处理的种子发芽率提高了33.66%；亚精胺预处理的种子发芽速度显著高于对照；亚精胺预处理显著提高了17天龄幼苗的鲜重和株高；亚精胺预处理不仅提高了种子的活力，而且对盐碱土中的种子活力也有积极影响。
亚精胺减少盐碱胁迫下的种子休眠时间。与对照处理相比，亚精胺预处理显著提高了种子中GA₃的含量，降低了ABA的积累，从而导致盐碱胁迫条件下种子ABA与GA₃的比值降低；此外，在盐碱胁迫下播种1-3天后，亚精胺预处理的种子中IAA的含量显著提高。
外源亚精胺间接刺激胞质Ca²⁺信号。与对照处理相比，亚精胺预处理导致羊草种子中H₂O₂积累增加30.38%，Ca²⁺积累增加了21.17%；为了进一步验证这一结果，研究使用DCFH2-DA和Fura-2-AM作为探针，定量分析了萌发种子中H₂O₂和Ca²⁺的相对分布。结果表明，亚精胺预处理后萌发种子中H₂O₂和Ca²⁺的荧光强度显着强于对照，亚精胺预处理种子中H₂O₂和Ca²⁺均表现出在胚中更特异的积累和富集。
亚精胺通过影响多胺氧化酶活性维持过氧化氢的平衡。与对照处理相比，外源亚精胺处理显著提高了盐碱胁迫下羊草种子的POD、GR、APX和CAT酶活性；与对照处理相比，亚精胺预处理的种子中的PA氧化酶活性增加了2.49倍；此外，与对照萌发种子相比，亚精胺预处理后的种子中的亚精胺合酶活性和编码亚精胺合酶基因的相对表达量分别增加了1.19倍和1.94倍；同样，亚精胺预处理后种子中的亚精胺含量在播种1天后增加了2.19倍，在播种3天后增加了2.03倍。
亚精胺减轻盐碱胁迫对质膜的损伤。在盐碱胁迫下，与对照相比，亚精胺预处理促进萌发种子中脯氨酸和可溶性糖含量积累；此外，与对照种子相比，亚精胺预处理种子中SOD活性在培养3天后增加了52.67%；与对照处理相比，亚精胺预处理的种子中超氧阴离子的荧光强度较弱，超氧阴离子含量也显示相似的趋势；与对照处理相比，亚精胺预处理的种子中的 MDA 含量在培养1天后下降了16.33%，在培养3天后下降了27.02%；值得注意的是，两种处理种子电导率的变化与MDA的积累完全一致。
亚精胺改变了差异表达基因的富集谱。转录组测序数据表明，与对照种子相比，亚精胺预处理的种子中共有1195个基因表现出显着差异表达，其中770个基因表达上调，425个基因表达下调；GO富集分析表明重要的GO术语分为生物过程、细胞成分和分子功能三个亚类，上调的DEG基因主要参与代谢过程和分子功能的生物调控。参与生物过程的DEGs影响氧化还原过程、调节初级代谢过程、分解代谢过程、离子跨膜转运、应激反应和脂质代谢过程；而参与分子功能的DEGs参与离子结合，如作为钙调蛋白结合转录激活剂；氧化还原酶活性，例如 NAD(P)-连接的氧化还原酶；阴离子结合；碳水化合物衍生物结合；和离子跨膜转运蛋白活性，例如无机磷酸盐转运蛋白。KEGG分析还表明DEGs主要参与氧化磷酸化、氮代谢，如谷胱甘肽S-转移酶；柠檬酸循环（TCA循环）；碳代谢，如1,3-β-葡聚糖基转移酶；次生代谢物和氨基酸的生物合成。

结论

如图4所示，外源亚精胺不仅在增加兼容性代谢物的积累方面发挥渗透调节作用，而且还参与萌发种子中PA（多胺）合成途径以增强PAO酶（PA氧化酶）活性，从而在盐碱胁迫下平衡羊草种子中H₂O₂的产生和去除过程中发挥调节作用。在盐碱胁迫下，H₂O₂的有益积累促进了细胞质Ca²⁺的积累，H₂O₂和胞质Ca²⁺信号共同维持了羊草萌发种子中ABA 和GA之间的平衡，从而缩短了休眠期，提高了种子活力和发芽率。亚精胺介导过程中内源性PAs、H₂O₂和 Ca²⁺在细胞质和激素的有益积累表明，这项研究不仅揭示了盐碱条件下羊草萌发种子中亚精胺引发的调控途径的新见解，同时也为适当施加外源PA促进植物种子萌发提供科学参考。

.图4. 盐碱胁迫条件下亚精胺介导羊草种子抗性的推测调控模型。

测试液

0.1 mM CaCl₂, 0.1 mM KCl, 0.1 mM MgCl₂, 0.5 mM NaCl, 0.3 mM MES, 0.2 mM Na₂SO₄, pH 6.0

NMT实验标准化方案

·盐胁迫研究NMT标准化方案

NMT仪器信息

·活体培养环境监测仪

·智能自动化非损伤微测系统

原文链接：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2021.701538/full

供稿：赵雪琦
编辑：刘兆义

关键词：萌发；羊草；多胺氧化酶；盐碱胁迫；亚精胺；植物类

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