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山农：NMT发现盐胁迫下过表达VviHKT1;7促葡萄根排Na+保K+ 为其可提高植物耐盐能力提供证据
转自中关村旭月非损伤微测技术产业联盟
基本信息
主题：NMT发现盐胁迫下过表达VviHKT1;7促葡萄根排Na+保K+ 为其可提高植物耐盐能力提供证据
期刊：中国农业科学
研究使用平台：NMT植物耐盐创新平台
标题：葡萄钾离子转运基因VviHKT1;7在盐胁迫下的功能鉴定
作者：山东农业大学杜远鹏、刘闯
检测离子/分子指标
Na+、K+
检测样品
葡萄根，距根尖600 μm根表上的点
中文摘要
【目的】探讨VviHKT1;7在葡萄抗盐机制中的作用，为后续培育抗盐品种提供理论参考。【方法】利用DANMAN和MEGA软件对葡萄HKT进行生物学信息分析。以抗盐性较强的砧木SA15和SA17以及生产上常用砧木1103P组培苗为材料，用100 mmol·L-1 NaCl分别处理0、3、6、12、24和48 h，以清水处理相应时间为对照，荧光定量PCR（qRT-PCR）检测HKT1在葡萄根部的相对表达量；以SA17的cDNA为模板克隆基因，连接表达载体pRI101-AN-GFP，利用农杆菌侵染法侵染拟南芥花序，在抗性MS板上筛选直到获得T3纯合株系；将野生型与转基因拟南芥种子播种于MS板和含有150 mmol·L-1 NaCl的MS板上，观察其发芽和生长情况并统计根长及鲜重；利用发根农杆菌技术获得SA17 转基因葡萄根系，100 mmol·L-1 NaCl处理24 h后，利用基于非损伤微测技术（NMT）活体生理检测仪检测野生型和转基因葡萄根系Na+的净流速以及盐胁迫下K+瞬时流速。【结果】多序列比对和系统进化树分析表明，葡萄HKT之间同源性较高，其中VviHKT1;7开放阅读框序列长度为1380bp，与VviHKT1;6的亲缘关系最近。盐胁迫显著诱导了葡萄HKT1在3个品种中的表达，其中VviHKT1;7的相对表达量上调较高，长时间胁迫后表达量仍有上升趋势，胁迫6或12 h时表达量达到峰值，且在耐盐性强的SA17、SA15中表达量明显高于1103P。拟南芥的发芽与生长结果表明，正常情况下野生型和转基因拟南芥的发芽和生长情况无显著差异，但盐胁迫下转基因拟南芥的发芽率、根长、鲜重明显高于野生型。荧光检测结果表明，转基因葡萄根系在荧光下可以明显看到绿色荧光，而野生型根系检测不到荧光；进一步qRT-PCR检测结果表明，转基因葡萄根系中VviHKT1;7的表达量是野生型根系的20多倍。离子流速检测结果表明，正常情况下野生型和转基因根系Na+净流速显示出外排，各个时间段的波动幅度较小且无显著差异，平均净流速分别为208和205 pmol·cm-2·s-1；盐胁迫后，两者Na+净流速明显增大，各个时间段的波动幅度增大，平均净流速分别为1053和1340pmol·cm-2·s-1。正常情况下两种根系K+吸收与外排处于动态平衡状态，盐胁迫显著诱导K+外排，转基因根系的外排速率明显小于野生型，分别为406和952 pmol·cm-2·s-1，表明转基因植株根系的Na+外排、K+保持能力明显大于野生型。【结论】VviHKT1;7在葡萄响应盐胁迫中发挥着重要作用，过表达该基因可以提高拟南芥和葡萄根系在盐胁迫下的适应能力。
离子/分子流实验处理方法
①0、100 mmol·L-1 NaCl 胁迫24 h（测Na+）
②100 mmol·L-1 NaCl实时处理（测K+）
离子/分子流实验结果
正常情况下，野生型和转基因葡萄根系Na+外排较低，约200 pmol·cm-2·s-1；100mmol·L-1 NaCl处理24 h后，Na+外排的净流速明显增大，转基因根系外排能力明显大于野生型（图1B）。如图1C所示，在15 min测量过程中，正常条件下根系Na+平均净流速无明显差异，盐胁迫后转基因根系平均净流速明显高于野生型，进一步说明转基因根系可以更有效地调控Na+外排。
图1. Na+净流速的检测。正值代表Na+外排。
如图2所示，在加入NaCl 前，野生型和转基因根系K+流呈现吸收与外排的动态平衡中，且流速相对比较平稳。当施加100 mmol·L-1 NaCl后，迅速增加了葡萄根系K+的外排，但转基因根系的增加幅度明显小于野生型。
图2. 野生型和转基因葡萄根系的K+净流速的检测。正值代表K+外排。
其他实验结果
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对葡萄HKT家族蛋白序列进行比对发现，6个葡萄HKT蛋白相似度为60.25%，并且都含有HKT蛋白家族特有的结构功能域TrkH。 -
将葡萄HKT蛋白序列与其他物种蛋白序列构建系统进化树，发现VviHKT1;7、VviHKT1;6和VviHKT1;8的亲缘关系较近；VviHKT1;1和VviHKT1;3亲缘关系最近；而VviHKT1;2则与大豆中的GmHKT1亲缘关系最近。 -
NaCl胁迫下所有HKT在SA17、SA15、1103P根系中的表达量升高。胁迫12 h后，VviHKT1;1、VviHKT1;2、VviHKT1;3、VviHKT1;6、VviHKT1;8的表达量普遍下降，而VviHKT1;7的表达量呈现下降后上升的趋势。 -
TaWRKY70增加了酵母的Cd富集能力。 -
Western blot分析表明，TaWRKY70在只转基因植株中表达；在Cd处理下，WT株系的发芽率、初生根长、生物量小于TaWRKY70转基因植株；这些结果表明，TaWRKY70参与了拟南芥对Cd胁迫的响应，增强了拟南芥对Cd的耐受性。 -
盐胁迫抑制了种子的发芽，且对野生型种子抑制更明显。 -
转基因拟南芥在盐胁迫下的生长状况明显好于野生型。 -
转基因根系目的基因的表达量显著高于野生型。
测试液
0.1 mM NaCl, 0.1 mM KCl, 0.1 mM CaCl2, 0.3 mM MES, pH 6.0
结论
盐胁迫显著诱导葡萄HKT家族成员表达量上调，其中VviHKT1;7上调最显著；异源过表达VviHKT1;7可以提高拟南芥在盐胁迫下的适应能力，同源过表达该基因可以提高葡萄根系在盐胁迫下的Na+排出和K+保持能力。
NMT实验标准化方案
NMT仪器信息
原文链接：http://qikan.cqvip.com/Qikan/Article/Detail?id=7104648808
供稿：赵雪琦
编辑：刘兆义
关键词：葡萄；VviHKT1;7；盐胁迫；转基因；功能鉴定；植物类
