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巴尔的摩生物医学研究中心:NMT发现谷氨酸促胞内Ca2+浓度↑耗O2量↑ 为证明激活谷氨酸受体会导致细胞内ATP损耗提供证据

转自中关村旭月非损伤微测技术产业联盟

 

 

 

 

 

 

基本信息

主题:NMT发现谷氨酸促胞内Ca2+浓度↑耗O2量↑ 为证明激活谷氨酸受体会导致细胞内ATP损耗提供证据

期刊:Journal of Neurochemistry

标题:Simultaneous single neuron recording of O2 consumption, [Ca2+]i and mitochondrial membrane potential in glutamate toxicity

者:巴尔的摩生物医学研究中心Mark P.Mattson、Marc Gleichmann

 

检测离子/分子指标

O2

 

检测样品

皮质神经元

 

 

中文摘要(谷歌机翻)

      为了确定谷氨酸毒性的细胞过程顺序,研究同时记录了单个皮质神经元的O2消耗量、细胞Ca2+浓度([Ca2+]i)和线粒体膜电位(mΔψ)。使用安培自交铂电极邻近神经元测量耗氧量,其中[Ca2+]i和mΔψ分别用Fluo-4和TMRE+监测,使用旋转盘激光共聚焦显微镜。谷氨酸的兴奋毒性剂量引起[Ca2+]i的升高,随后几秒钟内O2消耗量增加,在1-5分钟内达到最大值。在这段时间内,mΔψ发生了适度的增加,然后,在达到最大O2消耗前不久,mΔψ,如TMRE+荧光所示,消散了。最大O2消耗持续5分钟,然后与mΔψ和ATP水平一起下降,而[Ca2+]i进一步增加。当神经元在[Ca2+]i增加后不久用NMDA受体拮抗剂处理时,mΔψ和[Ca2+]i恢复到基线水平。本研究前所未有的空间和时间分辨率揭示了这一事件序列在所有神经元中是相同的,尽管O2消耗、[Ca2+]i和mΔψ的变化幅度和动力学具有相当大的差异性。使用这种新方法获得的数据与谷氨酸受体激活后几分钟,尽管线粒体呼吸达到最大,但Ca2+内流导致ATP耗竭的模型一致

 

 

离子/分子流实验处理方法

培养14天的皮质神经元
950 ng/mL寡酶素
10 μM 鱼藤酮
100 nM~1 μM FCCP
1~32 μM谷氨酸

 

 

离子/分子流实验结果

在最初的一系列实验中,在从神经元簇中记录到稳定的耗氧量后,施加寡霉素阻断线粒体ATP的合成。耗氧量至基础水平的21.8±2.1%(图1c),进一步添加鱼藤酮[阻断电子传输链复合物I(ETC)],耗氧量降至11.8 %±2.1%(图1c)。这一结果表明,大脑皮层神经元平均88.2%的氧消耗需要用来驱动ETC,但只有78.2%需要用来产生ATP。10%的差异很可能用于线粒体解偶联和钙缓冲。因此,剩余的11.8%的神经元耗氧量与ETC无关,可能包括其他氧库,如过氧化物酶体或额外的耗氧反应(如线粒体的解毒)。

研究接下来测量单个神经元的氧消耗(图1d)。加入寡霉素后单个神经元的氧消耗下降速度比神经元团簇快,很可能反映了寡霉素进入整个神经元的扩散速度更快。单个神经元通常具有1~5 pmol cm-2s-1的O2流速,这似乎与神经元的大小有关(较大的神经元表现出较高的O2消耗速率)。

 

图1. 单个神经元(c)和神经元簇(d)中的耗氧量。添加寡霉素和鱼藤酮后的稳定阶段用橙色条表示,这段时间的平均流速值在下面。bck表示记录在神经元层上方400 μm处的背景信号,在该区域没有O2流速。黑线表示时间刻度正值代表O2吸收

 

为了评估神经元的最大呼吸能力,在加入浓度逐渐增加的解偶联剂FCCP后,测量耗氧量(图2a和b)。引起最大耗氧量的FCCP的最佳剂量在单个神经元之间差异很大,范围从100 nM到1 μM。诱导的最大耗氧量,只能维持5 min左右或更短的时间,随后5~30 min内逐渐下降至或接近零(图2a和b)。FCCP浓度的增加(高于诱导最大耗氧量所需的浓度)缩短了最大耗氧量持续的时间,加速了之后的下降。

谷氨酸浓度的增加导致耗氧量的增加(图2c和d)。引起最大响应的浓度范围,神经元簇为10~32 μM,单个神经元为7~32 μM。持续的氧消耗在神经元簇中持续长达10 min,在单个神经元中持续1~5 min。单个神经元的耗氧量通常比神经元簇中的耗氧量下降得更快,这表明对神经元群体的检测结果使群体内单个神经元对谷氨酸的耗氧反应所持续时间被高估。谷氨酸浓度的进一步增加不会导致耗氧量的进一步增加。平均而言,谷氨酸使神经元簇中耗氧量增加至对照组的213±35%(图2和g)。因此,由谷氨酸诱导的耗氧量增加的幅度与由FCCP诱导的增加相似。以单一(最佳)剂量而不是逐步增加剂量施加谷氨酸会导致相同的反应。

为了确定谷氨酸确实可以诱导神经元中最大的耗氧量,在谷氨酸后不久加入FCCP。随后添加的FCCP不会引起氧消耗的进一步增加(图2e, f)。在这一系列实验中,仅谷氨酸使耗氧量比基础水平增加了250±22%,随后添加FCCP则没有其他作用(基础水平为247±47%;图2h)。如果与之前发表的小脑颗粒神经元结果相比,本研究的数据表明皮质神经元需要更低剂量的谷氨酸才能达到最大呼吸水平(皮层神经元33 μM,小脑神经元100 μM),这与皮质神经元对谷氨酸毒性的敏感性更高相一致。小脑颗粒细胞在人工脑脊液(ACSF)中的最大呼吸作用比基础值高250~275%,略高于皮质神经元,可能与小脑颗粒细胞对兴奋性毒性的抵抗有关。

 

图2. FCCP和谷氨酸引起皮质神经元最大的O2流速。添加FCCP(a+b)、谷氨酸(c+d)和FCCP后加谷氨酸(e+f)处理下神经元簇(a、c和e)和单个神经元(b、d和f)中O2流速的动态记录。添加的药物和浓度用棕色(FCCP)和红色(谷氨酸)线表示。时间刻度用黑线表示,bckg表示背景信号。FCCP和谷氨酸处理后O2流速的平均值和峰值(g、h、i、j)。正值代表O2吸收

 

 

测试液

120 mM NaCl, 3.1 mM KCl, 0.4 mM KH2PO4, 20 mM Tris, 5 mM NaHCO3, 1.2 mM NaSO4, 1.3 mM CaCl2,15 mM glucose, pH 7.4

 

 

文章简介

神经元是可兴奋性细胞,在突触活动及产生动作电位后,神经元要产生大量的ATP驱动离子泵以提高胞内的Na+和Ca2+水平。谷氨酸(Glu)是重要的神经递质,负责快速突触传递及突触传递强度的长期变化,并参与认知和记忆等过程;但如果过度激活谷氨酸受体,谷氨酸会导致离子平衡破坏、细胞死亡等毒性反应。本文为明确谷氨酸神经毒性的机制,将非损伤微测技术与激光共聚焦技术结合,以大鼠幼崽大脑皮层的神经元为被测样品,用非损伤微测技术检测单个神经元O2消耗量(即O2内流),而用激光共聚焦技术检测其胞内Ca2+浓度和线粒体膜电位。研究发现,在谷氨酸作用下,细胞内Ca2+浓度上升,随后O2消耗量增加,这期间线粒体膜电位也发生相应改变。该结论直接证实了下述谷氨酸毒性机理模型:谷氨酸受体被激活后能引起Ca2+内流,导致细胞内ATP损耗。
将非损伤微测技术与激光共聚焦等技术相结合,检测生物样品内部和外部离子分子或其他信息的变化情况,已经成为揭示生命过程机理机制的重要手段。

 

 

 

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19226367/

 

供稿:赵雪琦
编辑:杨爽
校稿:卻彦晗