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台湾中研院：NMT发现盐分刺激下谷氨酰胺转运蛋白突变青鳉鳃上皮Na+流速下降 为谷氨酸/谷氨酰胺参与鳃细胞的渗透调节提供支持

转自中关村旭月非损伤微测技术产业联盟

 

 

 

 

 

 

 

基本信息

主题：NMT发现盐分刺激下谷氨酰胺转运蛋白突变青鳉鳃上皮Na+流速下降 为谷氨酸/谷氨酰胺参与鳃细胞的渗透调节提供支持

期刊：Scientific Reports

影响因子：3.998（2020年）

研究使用平台：NMT斑马鱼创新平台

标题：Energy and nitrogenous waste from glutamate/glutamine catabolism facilitates acute osmotic adjustment in non-neuroectodermal branchial cells

作者：中央研究院细胞与个体生物学研究所曾庸哲、Pei-Chen Huang

 

检测离子/分子指标

Na+

 

检测样品

青鳉鳃上皮表面

 

中文摘要（谷歌机翻）

维持平衡是动物在渗透压扰动下最重要的生理反应之一。鳃上皮的离子细胞是负责主动离子转运的主要细胞类型，由耗能离子泵（如Na+-K+-ATPase、NKA）和次级主动转运蛋白介导。因此，除了渗透压调节外，充分和立即的能量补充对于适应渗透变化至关重要。本研究提出谷氨酸/谷氨酰胺分解代谢和含氮废物的跨上皮转运可能有助于广盐硬骨鱼日本青鳉（Oryzias latipes）适应渗透变化。在72 h的驯化期内，高渗刺激增加了鳃中谷氨酸家族氨基酸的含量。氨基酸的这种变化伴随着谷氨酸/谷氨酰胺转运体（Eaats，Sat）和合成酶（Gls，Glul）的刺激，它们在适应高渗条件期间参与调节鳃上皮中的谷氨酸/谷氨酰胺循环。谷氨酰胺酶和谷氨酰胺合成酶的原位杂交结合免疫细胞化学显示olgls1a和olgls2部分共定位，但olglul与富Na+/K+-ATPase的离子细胞不共定位。另外，对于谷氨酸和谷氨酰胺转运体，发现oleaat1、oleaat3和lslc38a4与离子细胞有共定位，而oleaat2没有共定位。Morpholino敲除Sat降低了幼鱼上皮的Na+流速，表明谷氨酸/谷氨酰胺转运在渗透调节中的重要性。除了作为能量底物的作用外，谷氨酸脱氨产生NH4+，这可能有助于渗透物质的产生；编码尿素生产周期成分的基因，包括氨甲酰磷酸合成酶（CPS）和鸟氨酸转氨甲酰酶（OTC），在高渗刺激下上调。基于这些发现，目前的研究表明，谷氨酸/谷氨酰胺循环和随后的鳃上皮含氮废物的跨上皮转运是在高渗刺激下维持离子稳态的一个重要组成部分。

 

离子/分子流实验处理方法

对6-dpf青鳉注射1 ng SAT-吗啉修饰反义寡核苷酸（MOs）。

 

离子/分子流实验结果

      在20‰ salinity brackish water (BW)环境中，与Wt和Sham组相比，谷氨酰胺转运蛋白突变体组（Sat-MO）的鳃上皮Na+流速，显著下降（67%）。

 

图1. SAT-吗啉修饰反义寡核苷酸（MOs）对6 dpf 青鳉幼鱼卵黄囊上皮Na+流速的影响。正值代表Na+外排。

 

其他实验结果

  • 与FW对照组相比，用20‰ BW处理72 h的青鳉的O:N比发生了明显变化。

  • 与FW对照组相比，20‰BW处理后，青鳉鱼鳃中谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸和氨含量都有所增加。

  • 20‰BW处理后，鳃组织中的尿素含量显著增加。

  • 20‰BW处理后，olcps1、olotc上调表达，但是20‰BW在任何一个处理时间都没有明显诱导olcps2的表达；另外，Rh蛋白均下调表达。

  • 72 h处理后，20‰BW暴露显著刺激olgls1a和olgls2的表达。然而，20‰的BW在任何一个处理时间都没有诱导olgls1b的表达；另外，20‰BW处理6 h和72 h后，glul的转录表达显著上调。

  • olgls1a、olgls2和olglul三个基因都表现得卵黄囊鳃上皮细胞的典型特征。

  • 谷氨酸转运体（Eaats）、olslc1a1、olslc1a2a、olslc1a2b和olslc1a3，以及谷氨酰胺转运体（SAT）、olslc38a4和olslc38a5均在青鳉鳃中表达。

  • olslc1a1，olslc1a2b，olslc1a3和olslc38a4在卵黄囊的表皮细胞中表达，并表现出典型的“盐和胡椒样”模式表皮离子细胞染色。谷氨酸转运体直向同源物Eaat3部分与NKA信号共定位。此外，发现所有Eaat1的mRNA信号均与卵黄囊鳃上皮中的NKA阳性细胞和邻近的鳃上皮细胞共定位。

 

结论

      这项研究首次阐明了非必需的AAs，谷氨酸和谷氨酰胺是如何参与鳃内NH3/NH4+生成和尿素积累的，为渗透调节的能量学提供了新的见解。此外，谷氨酸/谷氨酰胺转运体和分解代谢调节剂Eaat、Sat、Gls和Glul在青鳉鳃上皮细胞中的表达模式不仅为研究功能不同的鳃上皮细胞之间潜在的AA转运途径提供了新的见解，同时也开始阐明谷氨酸/谷氨酰胺在鱼类渗透调节中的分子和细胞利用。此外，目前的研究表明谷氨酸-谷氨酰胺循环的特征可能通常来源于表皮的发育，因为在脊椎动物的神经外胚层衍生的中枢神经系统和非神经外胚层衍生的鳃上皮中都有发现。这些发现强调了通过谷氨酸/谷氨酰胺代谢产生基于NH4+的尿素的重要性，这有助于在广盐硬骨鱼中建立良好的渗透调节能力（图2）。

 

图2. 谷氨酸是一种主要的等离子体驱动的能量底物，在应对盐分刺激时被转运到鳃中。

 

离子流实验使用的测试液

0.5 mM NaCl, 0.2 mM CaSO4, 0.2 mM MgSO4, 300 μM MOPS buffer, 0.3 mg·L-1 ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate

 

NMT实验标准化方案

·斑马鱼NMT标准化方案

 

NMT仪器信息

·活体培养环境监测仪

·智能自动化非损伤微测系统

 

 

 

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41598-020-65913-1

 

关键词：Na+流速；青鳉；鳃上皮细胞；谷氨酸/谷氨酰胺；渗透刺激；生医动物类

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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