南土所新植物学家：NMT发现WRKY46通过调控蛋白N糖基化和游离IAA含量抑制根排铵为探究WRKY46调控铵耐受机制提供证据

转自中关村旭月非损伤微测技术产业联盟

感谢本文一作，中科院南京土壤研究所狄东伟博士校稿

基本信息

主题：NMT发现WRKY46通过调控蛋白N糖基化和游离IAA含量抑制根排铵为探究WRKY46调控铵耐受机制提供证据

期刊：New Phytologist

影响因子：10.151

研究使用平台：NMT植物营养创新平台

标题：WRKY46 promotes ammonium tolerance in Arabidopsis by repressing NUDX9 and IAA-conjugating genes and by inhibiting NH₄⁺ efflux inthe root elongation zone

作者：中科院南京土壤研究所李光杰、狄东伟

检测离子/分子指标

NH₄⁺

检测样品

拟南芥根分生区、伸长区

中文摘要（谷歌机翻）

中等水平的铵（NH₄⁺）对大多数植物的根系生长具有毒性作用。转录调控是植物响应NH₄⁺毒害最重要的机制之一，但转录因子（TFs）参与这一调控的具体机制尚不清楚。
研究对拟南芥根部进行了RNA-seq分析，以筛选对铵响应的TFs。筛选出来的WRKY46是WRKY转录因子家族中对NH₄⁺最敏感的成员。研究通过突变和过表达实验确定了WRKY46的作用，并通过Y1H、EMSA和ChIP-qPCR来表征WRKY46对NUDX9和IAA结合基因的调控。
敲除WRKY46会增加NH₄⁺对主根的抑制，而过表达WRKY46会减少NH₄⁺对主根的抑制。WRKY46与NUDX9和IAA结合基因（GH3.1, GH3.6, UGT75D1, UGT84B2）启动子直接结合，抑制其转录，从而正调节游离IAA含量，稳定蛋白N-糖基化，抑制根伸长区（EZ）NH₄⁺外排。
研究发现TF参与调节EZ中的NH₄⁺外排，表明WRKY46通过负调节NUDX9和IAA结合基因来抑制NH₄⁺外排。

离子/分子流实验处理

在含有0、30 mM NH₄Cl、30 mM NH₄Cl+5 nM IAA、30 mM NH₄Cl+1.5 μM L-Kyn培养基上生长12 h。

离子/分子流实验结果

先前的研究表明，EZ处NH₄⁺流速增加是NH₄⁺胁迫下主根（PR）生长抑制的关键特征之一。由于WRKY46主要在EZ中表达并正调节EZ的生长，本研究想知道 WRKY46在高NH₄⁺下促进PR的生长是否与NH₄⁺流速调节有关。因此，检测了Col、wrky46和WRKY46ox在分生区（MZ）和EZ的NH₄⁺净流速。在高NH₄⁺条件下，三个基因型的MZ和EZ的NH₄⁺外排均增加，wrky46的MZ增加率（120.6%）略高，而WRKY46ox的增加率（73.5%）低于Col（100.5%）（图1a, c）。Col的EZ中NH₄⁺的净外排速率为166.608 pmol cm^-2s^-1，而在wrky46中增强到280.895 pmol cm^-2s^-1，但在WRKY46ox中被抑制到86.170 pmol cm^-2s^-1（图1b, c），表明WRKY46确实负向调节EZ的NH₄⁺流速。

图1.WRKY46负调控根中NH₄⁺的流速，特别是在伸长区。正值代表NH₄⁺外排，负值代表NH₄⁺吸收。

为了检验WRKY46是否通过NUDX9依赖的N-糖基化调节NH₄⁺外排，研究测定了nudx9、wrky46/nudx9、WRKY46ox/nudx9和Col的根系NH₄⁺流速。在高NH₄⁺条件下，nudx9 MZ的NH₄⁺外排速率为78.071 pmol cm^-2s^-1，显著低于Col（154.205 pmol cm^-2s^-1），但在WRKY46ox/nudx9中下降到60.335pmol cm^-2s^-1，在wrky46/nudx9双突变体中上升到118.509 pmol cm^-2s^-1（图2a,b）。在高NH₄⁺条件下，nudx9突变体EZ的NH₄⁺外排速率为Col的44.3%，wrky46/nudx9的NH₄⁺外排速率增加，而WRKY46ox/nudx9的NH₄⁺外排速率降低到Col的34.9%（图2d）。结合前期vtc1-1突变体NH₄⁺外排增加的报道，本数据证实了蛋白N-糖基化对根系NH₄⁺外排的正向调控作用。

图2. WRKY46在一个NUDX9依赖的途径中调节NH₄⁺流速。正值代表NH₄⁺外排，负值代表NH₄⁺吸收。

为了进一步研究IAA与WRKY46调控NH₄⁺流速的关系，研究测定了在施加外源IAA（5 nM）的高NH₄⁺培养基条件下的NH₄⁺流速。当在高NH₄⁺培养基中加入低剂量IAA时，NH₄⁺流速下降到Col 和wrky46 MZ类似水平（图3a, b）。同样，加入低剂量的IAA后,在高NH₄⁺培养基上生长的Col和wrky46的EZ中NH₄⁺的外排也减少（图3c, d）。IAA在wrky46中的作用更为明显（图3b, d），表明IAA依赖的途径也参与了WRKY46对NH₄⁺流速的调控。

为了进一步确定IAA对NH₄⁺流速的作用，作者直接测定了gh3.6（游离IAA升高突变体）和UGT75D1ox（游离IAA降低突变体）的NH₄⁺流速。在高NH₄⁺处理后，gh3.6 EZ的NH₄⁺外排速率比Col低，但UGT75D1ox的NH₄⁺外排速率则更高（图3c, d）。与Col相比，在高NH₄⁺条件下，gh3.6 MZ的NH₄⁺外排被抑制，但在UGT75D1ox中被促进（图3a, b）。同时，当在培养基中加入外源IAA时，UGT75D1ox的MZ和EZ中的NH₄⁺外排速率减少到与Col相似水平。数据表明，IAA主要抑制根系EZ中的NH₄⁺外排，WRKY46通过调节IAA的积累参与这一过程。

图3.WRKY46参与调控高NH₄⁺胁迫下根系伸长区NH₄⁺流速。正值代表NH₄⁺外排，负值代表NH₄⁺吸收。

为了进一步研究IAA在NH₄⁺外排中与N-糖基化有关的作用，研究检测了vtc1-1在高NH₄⁺加IAA下的NH₄⁺流速，以及nudx9在高NH₄⁺加L-Kyn（一种IAA生物合成抑制剂）下的NH₄⁺流速。与以前的报道一致，在高NH₄⁺处理下，vtc1-1的MZ和EZ的NH₄⁺外排速率比Col的增加更多（图3, 4 b-d）。然而，与生长在高NH₄⁺培养基上的植物相比，在高NH₄⁺培养基中施加外源IAA时，Col和vtc1-1的MZ和EZ中的NH₄⁺外排速率减少，表明VTC1依赖的NH₄⁺外排部分依赖于游离IAA含量（图3, 4 b-d）。相比之下，外源L-Kyn增加了MZ和EZ的NH₄⁺流速（图4b-d）。这些结果表明，N-糖基化依赖的NH₄⁺流速部分取决于根IAA含量。

图4.蛋白质N-糖基化和NH₄⁺流速部分依赖IAA含量。正值代表NH₄⁺外排，负值代表NH₄⁺吸收。

其他实验结果

pWRKY46::GUS表达显示，高NH₄⁺诱导根中，尤其是根尖部位WRKY46上调。敲除及过表达株系表型分析表明，WRKY46主要在根EZ部位发挥功能，并正调控高NH₄⁺条件下的主根生长。
qRT-PCR 结果表明VTC1不是WRKY46的下游靶基因。
通过ChIP-qPCR、Y1H及LUC活性检测发现，WRKY46直接与NUDX9启动子结合并负调控该基因的转录。
MZ和EZ的长度测量显示Col、wrky46、WRKY46ox、nudx9、wrky46/nudx9、WRKY46ox/nudx9在高NH₄⁺条件下MZ长度与各自的亲本相比没有显著差异；而EZ长度存在显著差异。
WRKY46调控根部蛋白N-糖基化水平。
NUDX9作用于WRKY46下游并参与WRKY46依赖的高NH₄⁺响应，但该过程还包含其他下游靶基因的参与。
外源IAA部分恢复高NH₄⁺诱导的主根生长抑制。
编码IAA结合蛋白的基因的转录参与了高NH₄⁺条件下主根生长调控。
WRKY46直接与IAA结合基因（GH3.1、GH3.6、UGT75D1、UGT84B2）的启动子结合并抑制它们的转录。
WRKY46通过促进IAA代谢而非抑制IAA合成降低游离IAA含量。
蛋白N-糖基化是在高NH₄⁺条件下维持游离IAA的必要条件。

结论

研究提出WRKY46对蛋白质N-糖基化和游离IAA的调节可能作为NH₄⁺胁迫下的一种保护机制。高NH₄⁺诱导WRKY46的表达，WRKY46的积累对NUDX9和IAA结合基因的转录有负调节作用。因此，在根部发生了更多的蛋白质N-糖基化，更高的游离IAA和NH₄⁺外排降低（图5）。然而，当NH₄⁺胁迫变弱或消失时，游离IAA的积累会负调节WRKY46的表达，正调节IAA结合基因的表达，使根部的IAA含量维持在很低的范围内。而且，WRKY46在高NH₄⁺下作为生长素稳定剂发挥作用，有助于维持根系相对稳定的游离IAA水平。本研究结果为蛋白质N-糖基化、游离IAA和NH₄⁺外排如何共同调节NH₄⁺胁迫提供了新的见解。总之，WRKY46可能是开发高NH₄⁺耐受性作物品种的宝贵遗传资源，深入了解高NH₄⁺条件下蛋白质N-糖基化、游离IAA和NH₄⁺外排的相互作用为提高植物对NH₄⁺的耐性提供了新的线索。

图5.WRKY46在高NH₄⁺胁迫下的工作模型。

测试液

0.2 mM NH₄Cl, 0.1 mM CaCl₂, pH 5.7

NMT实验标准化方案

·植物营养研究NMT标准化方案

NMT仪器信息

·活体培养环境监测仪

·智能自动化非损伤微测系统

原文链接：https://nph.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/nph.17554

关键词：铵毒；根生长抑制；WRKY46；排NH₄⁺；游离IAA；蛋白N-糖基化；植物类

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