主题： NMT在微生物（真菌、细菌）研究中的应用成果

细胞膜转运系统的活性对维持胞内的pH平衡，保持细胞的渗透势、营养吸收和清除细胞代谢中的毒物非常重要。当前电生理学和分子遗传学已经解释了质膜转运体在响应环境因子的感受过程和信号转导途径。质膜电势和离子流的变化是细胞响应温度、激素、渗透和机械刺激的最早期事件，这些变化和细菌的活性密切相关。然而，对细菌如何感受环境和细胞膜对环境的适应过程知之甚少。


自从2001年，非损伤微测技术第一次应用于细菌细胞的膜转运过程的研究，目前已经积累了很多信息。近年来，非损伤微测技术在动物、植物、真菌和细菌对环境的适应性研究中变得非常流行。本文总结了这些发现，讨论了非损伤微测技术在研究细菌对环境的适应性反应。首先，讨论了这个新技术在微生物中应用的方法学，然后，描述了几个实例（典型的研究）。最后总结了膜转运活性对不同胁迫（酸、渗透和温度）的反应，以及流速变化作为细菌生长时期和营养利用的功能指标。


非损伤微测技术测定的离子流可能在我们理解细菌、真菌和生物膜对不同环境条件下的适用性反应提供了许多概念上的进步。这个技术能够用于快速地评价食品的加工过程，减少细菌对食品的污染，以及发展一些评价生物对抗菌剂的抗性策略。非损伤微测技术是结构基因组学向功能基因组学转变的理想工具。

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细菌的生长与适应环境的能力依赖于营养吸收和代谢物的排出，膜转运系统在这个过程中发挥着重要作用。


本研究使用“非损伤微测技术（non-invasive ion-selective microelectrode technique，MIFE）”测量处于不同发育阶段的大肠杆菌胞外H⁺、Ca²⁺、K⁺及NH₄⁺离子流及相应的离子浓度，表征大肠杆菌的离子跨膜过程和膜转运系统。


除Ca²⁺外，其他离子在大肠杆菌的不同发育阶段离子流强度存在着显著差异，特别是H⁺流强度与大肠杆菌的生长发育过程密切相关。


非损伤微测技术对离子流的测量为研究微生物的生长发育过程提供了独特视角，可用于表征不同生长发育过程的不同生理机制。该方法也能为高等生物生长发育过程的研究提供重要参考。

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胞外高浓度的NaCl引起大量的Na⁺进入细胞，导致质膜去极化，使K⁺难以吸收。相反，电中性的非离子渗透物没有显著引起细胞膜的去极化。但是细菌细胞是否有这种变化还没有报道过。


澳大利亚塔斯马尼亚大学（University of Tasmania）Sergey Shabala实验室使用非损伤微测技术（NMT）等方法，研究了大肠杆菌在NaCl和蔗糖处理下K⁺流速的变化以及基因的表达，发现细菌通过增加有机渗透物质的合成，以及控制跨膜的离子流进而增加胞内的渗透压来适应高渗胁迫。研究表明，快速增加的高渗NaCl引起了K⁺的大量外流，导致胞内K⁺含量下降，同时Na⁺积累在细胞中。然而，等渗的蔗糖处理却缓慢增加了K⁺的吸收。NaCl和蔗糖处理大肠杆菌后上调的基因中有40%不同，进一步说明离子和非离子渗透调节作用具有显著的差异。


这篇文章揭示了细菌应对渗透胁迫的不同机制，给出了离子流的直接证据，说明了电压门控的K⁺通道对细菌适应高渗胁迫具有重要意义。

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丛枝菌根(arbuscular mycorrhiza，AM)真菌在自然界中广泛存在，能与绝大多数的陆地高等植物形成共生体系，是迄今发现的与植物关系最为密切的土壤微生物之一。很多研究表明，菌根共生体系对于植物适应各种逆境胁迫具有重要意义。有关丛枝菌根在植物抵御干旱胁迫中的积极作用已有较多文献报道，但多数研究集中在AM真菌的间接作用，及菌根影响植物自身抗旱生理方面，而对于AM真菌增强植物抗旱性的直接作用，尤其是干旱胁迫下AM真菌帮助宿主植物吸收水分的分子证据，还是一项研究空白。


2013年初，中国科学院生态环境研究中心陈保冬研究组在丛枝菌根提高宿主植物抗旱性分子机制研究方面取得重要进展，首次克隆和证实了AM的水通道及其功能，研究结果发表在国际著名植物学期刊《New Phytologist》（Impact Factor: 6.645）。


陈保冬研究组采用5-和3’-RACE技术，从AM真菌Glomus intraradices中克隆了两个水通道基因GintAQPF1和GintAQPF2。使用非损伤微测技术（NMT）测定了毕赤酵母的Ca²⁺和H⁺流速，发现25%的PEG促进了转染GintAQPF1和GintAQPF2基因的Ca²⁺内流和H⁺外流，1M的甘油抑制了Ca²⁺内流和H⁺外流，说明这两个水通道蛋白具有调控Ca²⁺信号和质子外排的作用，进一步证实了水通道蛋白的功能，尤其是在活体中的功能。


GintAQPF1和GintAQPF2是在AMF中第一次报道的两个功能性的水通道基因，水通过AMF运输到宿主植物，这就说明AMF在植物干旱忍耐中起到重要作用。该研究为丛枝菌根真菌吸收水分提供了直接的分子证据，有助于人们更全面地认识逆境胁迫下菌根真菌和宿主植物之间的互动机制，同时也揭示了AM真菌在维系干旱半干旱地区脆弱生态系统结构和功能稳定中的潜在重要作用。

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破囊壶菌是低等的真菌，生长在大量的Na⁺环境中。Na⁺参与细胞渗透调节和细胞代谢。渗透调节通过从环境中吸收无机离子，或者改变细胞质中可溶性物质的浓度来完成。通过质膜的渗透调节在转运过程中非常重要。但是在海洋原生生物中如何通过质膜进行渗透调节还不清楚。


澳大利亚的科学家Shabala等人用非损伤微测技术揭示了海洋原生生物破囊壶菌渗透调节的离子机制。发现低渗引起了破囊壶菌显著的Na⁺、Cl^-和K⁺的外流，胁迫初始的30min内完成了渗透调节。就这个细菌来说，Na⁺是主要的贡献者，在渗透调节中超过一半，Cl^-是第二个贡献者。K⁺ 在渗透调节过程中的作用相对较小。Ca²⁺和H⁺流速的变化主要归功于胞内的信号转导。通过生长实验整理了离子流的数据，即使当生长在一个没有Na⁺的环境中，只要维持合适的渗透势，即通过甘露醇调节和海水一样的渗透势时，破囊壶菌细胞也能正常生长。这说明Na⁺对破囊壶菌的生长不是必需的，因为Na⁺主要参与细胞代谢。


这项工作为细菌如何进行渗透调节提供了证据，发现破囊壶菌细胞在没有Na⁺的环境中也能够正常生长，证明了细胞的渗透/膨压也能通过其他方式进行调节以及调节的机制。

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生物反应器通常是被废水处理后生长在纤维膜上的细菌形成的生物膜（Biolfilm）。在生物膜与液体表面大量的水和生理转运之间的关系对于实时可控的生物反应器的运行非常重要。虽然大量的数据描述了膜曝气生物反应器（MABR）的流动情况，但是说明生理条件下分界层转运的实时数据非常少。


2010年8月底，普渡大学的科学家McLamore和Porterfield教授等人使用非损伤微测技术测定了成熟的亚硝化单胞菌（Nitrosomonas europaea）和假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）暴露于环境毒物中氧气和质子的流速，这种测定可以获得实时量化的数据。他们研究了这两种细菌形成的生物膜暴露于模式毒物CCCP和KCN以及4种环境毒物鱼藤酮、2,4-二硝基苯酚、CdCl₂、五氯苯酚中的氧气和质子的流速，发现暴露于这些毒物的亚致死浓度下导致了氧气和质子流速的大量增加。


这种实时的氧气和质子流速的微尺度标记（或者指纹）技术与液体分析技术相结合促进了对膜曝气生物反应器中逆扩散生物膜的生理解释，也提高了生物反应器的监测和模型化，为将来的废水监测和生物膜的研究提供了最新的手段。

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2008年4月，Feijó等科学家使用“非损伤微测技术(the ion-selective vibrating probe system)”研究了芽管菌丝发育时期菌丝中的H⁺流，发现胞外的pH在宿主和真菌间的离子交换和AM真菌生长中起到重要作用，菌丝的H⁺流振荡与芽管菌丝的生长存在相互关系，AM菌丝的H⁺流和生长被宿主根系分泌物(RE)所调控。菌丝H⁺流空间和时间的转变被营养利用状况所调控，也有可能被pH信号所诱导。


此项工作对于认识真菌的生长发育以及响应外源物质的机理提供了全新的思路，也揭示了菌丝对P和Suc利用的细胞生物学生理学机制。

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大多数豆科植物与真菌共生。丛枝菌根真菌（AM）对磷（P）的吸收和根瘤菌对氮（N2）的固定具有重要的农学和生态学意义。植物-AM真菌-根瘤菌三个共生如何高效吸收营养的机制受到很多关注。AM真菌和根瘤菌能够有效地增加固氮和植物对土壤中磷的吸收，但这破坏了根部阴阳离子平衡，过多的阳离子需要从根部分泌出来才能达到平衡，H⁺是分泌的最主要阳离子。然而，无论根瘤能够直接释放H⁺引起土壤的酸化，以及AM真菌怎么影响真菌菌根的这个过程还是不清楚。


2011年中国农业大学的科学家把丛枝菌根真菌（GM）和慢生大豆根瘤菌（BJ）注射到大豆苗中，通过原位的非损伤微测技术研究了两种真菌单独的作用和相互作用对根瘤或者根外菌丝的H⁺外流。GM把真菌菌根侧根根瘤的H⁺外流提高了3倍，BJ把侧根接近根瘤部位菌丝的H⁺外流提高了8倍。植物P含量的增加与根瘤和菌丝的H⁺外流呈显著的线性正相关。研究结果认为侧根AM真菌诱导了固氮酶的活性，增加了根瘤的H⁺外流。


这项研究使我们认识到真菌菌根和根瘤菌相互作用增加了根瘤空间和菌丝空间酸化的程度，对进一步研究植物固氮和P的作用提供了依据。

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白腐真菌黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）广泛用于废水处理。但是，要发展基于真菌的废水处理技术就需要获得真菌实时反应的数据和了解其中的机制。


2012年湖南大学曾光明、陈桂秋实验室在环境科学领域的顶级杂志《Environmental Science & Technology》（2011 IF 5.228）发表文章，用非损伤微测技术（noninvasive microtest technology，NMT）实时测定了白腐真菌（P. chrysosporium）暴露在环境毒物2,4-D和Cd2+下的H⁺、O₂和Cd²⁺的流速。发现白腐真菌暴露在10 mg/L 的2,4-D和0.1 mM 的Cd²⁺中H⁺和O₂的流速出现了显著改变，这种流速的改变与氧化胁迫有关。这项研究阐述了真菌对毒物反应的生理机制，为基于真菌的废水处理提供了新技术和新思路。


本文使用非损伤微测技术直接测定了真菌的生理变化，而生理变化通常是细胞对环境反应的最早事件，这为环境的预警和评价提供了非常有价值的工具，因此，NMT可用于环境的预警和评价。这篇文章是中国学者使用非损伤微测技术在环境领域的杂志发表的最高水平的文章。本文的流速数据全部在旭月公司的测试中心（www.xuyue.net）获得。

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