转自中关村旭月非损伤微测技术产业联盟

 

 

 

 

 

基本信息

主题：NMT发现低分子壳聚糖致斑马鱼皮肤细胞排Na⁺↑且能被缓冲成份缓解 为其生物毒性特征提供了新见解

期刊：Carbohydrate Polymers

研究使用平台：NMT毒理创新平台

标题：Characterization and toxicology evaluation of low molecular weight chitosan on zebrafish

作者：台北医学大学郑嘉雄、周志铭、糜福龙

 

检测离子/分子指标

Na⁺

 

检测样品

斑马鱼幼鱼上皮细胞

 

中文摘要（谷歌机翻）

      壳聚糖被认为是无或低毒、生物相容性好的生物材料。为了提高DNA或蛋白质的传递效率，通常采用壳聚糖的消化来降低分子量和制备纳米颗粒。然而，低分子量壳聚糖（LMWCS）对淡水鱼类的毒性尚未得到很好的评价。本研究使用斑马鱼（Danio rerio）肝脏（ZFL）细胞系、斑马鱼幼鱼和成年鱼研究了LMWCS的毒性机制。LMWCS迅速诱导ZFL细胞的细胞毒性和斑马鱼的死亡。LMWCS损伤细胞膜使细胞活力降低。斑马鱼幼虫上皮细胞膜受损导致卵黄囊破裂。由于LMWCS的多重损伤，成年鱼在死亡前表现出缺氧的症状。虽然在斑马鱼模型中发现了LMWCS的毒性，但其毒性仅在pH<7时存在，并且容易被其他负离子中和。总的来说，这些数据提高了对LMWCS特性的新理解。

 

离子/分子流实验处理

斑马鱼幼鱼被浸泡在10 μg/mL低分子壳聚糖（LMWCS）和10 μg/mL LMWCS+10 mM Na₂HPO₄中5 min后检测。

 

离子/分子流结果

      用非损伤微测技术对斑马鱼幼鱼上皮细胞释放的Na⁺进行实时检测。用10 μg/mL的LMWCS孵育后，斑马鱼幼鱼的上皮细胞迅速释放出Na⁺。用10 mM Na₂HPO₄中和可显著逆转Na⁺的外排。总的来说，这些数据表明LMWCS破坏了斑马鱼幼鱼的上皮细胞膜功能。

 

图1. LMWCS损伤斑马鱼幼鱼上皮细胞膜诱导离子外排。正值代表Na⁺外排。

 

其他实验结果

• LMWCS对斑马鱼幼鱼具有一定的毒性，PBS和Na₂HPO₄缓冲液均能有效地中和这种毒性。

• LMWCS导致斑马鱼幼鱼的上皮细胞严重受损，最终导致其死亡。

• 在斑马鱼幼鱼死亡前，可能引起卵黄囊上皮损伤和行为异常。

• LMWCS对斑马鱼肝脏细胞膜损伤具有细胞毒性。

• LMWCS破坏了成年斑马鱼的组织，鳃瓣损伤是成年斑马鱼死亡的主要原因。

• LMWCS在河水中也可导致斑马鱼死亡。

 

结论

      LMWCS可迅速导致斑马鱼幼鱼和成鱼在水中死亡，即使在正常的河水中也是如此。LMWCS靶向并破坏上皮细胞膜和鳃瓣，诱导斑马鱼幼鱼和成鱼死亡。此外，LMWCS对斑马鱼肝细胞、斑马鱼幼鱼和成鱼的毒性可以用Na₂HPO₄缓冲液中和。即使在斑马鱼模型中也发现了LMWCS的毒性，但由于LMWCS的水不溶性和易被其它负离子中和，其毒性只存在于pH<7的环境中这些结果提供了对LMWCS特性的新理解。

 

测试液

0.5 mM NaCl, 0.2 mM CaSO₄, 0.2 mM MgSO₄, 0.16 mM KH₂PO₄, 0.16 mM K₂HPO₄, pH 7.0

 

NMT实验标准化方案

·毒理研究NMT标准化方案

·斑马鱼NMT标准化方案

 

NMT仪器信息

·活体培养环境监测仪

·智能自动化非损伤微测系统

 

 

 

 

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0144861720303386

 

关键词：低分子量壳聚糖；纳米粒；毒性；斑马鱼；生医动物类

 

 

 

 

 

 

转自中关村旭月非损伤微测技术产业联盟

 

 

 

 台医大洪君琳：NMT探究以斑马鱼为材料的药物耳毒性机制

 

 

基本信息

主题：NMT发现氨暴露致斑马鱼毛细胞Ca²⁺和NH₄⁺吸收减少 为揭示氨的环境毒性机制提供重要证据

期刊：Chemosphere

影响因子：3.998（2020年）

研究使用平台：NMT毒理创新研究平台

标题：Ammonia exposure impairs lateral-line hair cells and mechanotransduction in zebrafish embryo

作者：台北医学大学洪君琳、台湾师范大学Jie-An Zheng、Shun-ChihHuang

 

检测离子/分子指标

Ca²⁺、NH₄⁺

 

检测样品

斑马鱼侧线毛细胞

 

中文摘要（谷歌机翻）

      氨（包括 NH₃和NH₄⁺）是淡水环境的主要污染物。然而，氨对鱼类早期的毒性作用还没有完全了解，对其对感官系统的影响知之甚少。本研究假设氨暴露会对胚胎发育造成不良影响，并损害鱼类的侧线系统。斑马鱼胚胎暴露于高氨水（10、15、20、25和30 mM NH₄Cl, pH 7.0）96 h（受精后0~96 h）。当NH₄Cl浓度≥15 mM时，斑马鱼体长、心率、耳囊大小显著下降，而当NH₄Cl≥10 mM时，侧线毛细胞数量和功能下降。采用非损伤微测技术（NMT）检测机械电转换（MET）通道介导的Ca²⁺内流，以揭示毛细胞的功能。研究发现NH₄⁺（≥5 mM NH₄Cl）进入毛细胞并抑制了毛细胞的Ca²⁺内流。新霉素和La³⁺（MET通道阻断剂）抑制NH₄⁺内流，表明NH₄⁺通过毛束中的MET通道进入毛细胞。总之，本研究表明，氨暴露（≥10 mM NH₄Cl）可对斑马鱼胚胎产生不良影响，侧线毛细胞对氨暴露敏感。

 

离子/分子流实验处理

①胚胎在浓度的NH₄Cl（0、5、10、20 mM）中孵育96h

②受精后96 h的胚胎在不同浓度的NH₄Cl（0、5、10、20 mM）中孵育0.5 h

③受精后96 h的胚胎在5 mM NH₄Cl或5 mM NH₄Cl加阻滞剂（10 mM新霉素或10 mM La³⁺）中孵育0.5h

 

离子/分子流结果

      用NMT分析毛束处Ca²⁺内流速率，评价毛细胞功能（图1A显示了流速微传感器检测L1神经丘毛束的图像）。10 mM组和20 mM组的Ca²⁺内流速率分别减少了33%和43%（图1B）。

 

斑马鱼侧线毛细胞Ca²⁺流速检测视频

 

 图1.受精后0~96 h高氨水暴露对毛细胞功能的影响。正值代表Ca²⁺内流。

 

      胚胎在NH₄Cl暴露30 min后，1、5和10 mM NH₄Cl组的Ca²⁺内流速率分别显著减少45%、65%和75%（图2A）。0和1 mM NH₄Cl组毛细胞的NH₄⁺流速非常低，而在5和10 mM NH₄Cl组中测量到显著的NH₄⁺内流（图2B）。

 

图2.高氨水暴露30 min对毛细胞Ca²⁺和NH₄⁺内流速率的影响。正值代表NH₄⁺、Ca²⁺内流。

 

      用La³⁺和新霉素来验证NH₄⁺在毛细胞的内流是通过MET通道介导的。将胚胎预暴露于5 mM NH₄Cl（含或不含阻断剂）30 min后，记录NH₄⁺在神经丘毛细胞的内流速率。结果表明，新霉素（10 mM）和La³⁺（10 mM）处理组的NH₄⁺内流速率分别减少了60%和50%（图3）。

 

图3.新霉素和La³⁺对毛细胞NH₄⁺流入的影响。正值代表NH₄⁺内流。

 

其他实验结果

• 氨暴露后，斑马鱼胚胎的体长、心率和耳泡大小均减小。

• 氨暴露后，侧线毛细胞的数量和功能下降。

• 外侧毛细胞对氨暴露敏感。

 

结论

      综上所述，本研究综述了亚致死氨暴露对斑马鱼胚胎早期发育和侧线毛细胞的毒性作用。数据表明，氨通过干扰MET通道介导的Ca²⁺内流而损害毛细胞。氨对鱼类侧线系统存在不利影响，可能影响鱼类的行为，对自然生态系统中的鱼类生存造成严重威胁。

 

测试液

0.5 mM NaCl, 0.2 mM CaSO₄, 0.2 mM MgSO₄,0.16 mM KH₂PO₄, 0.16 mM K₂HPO₄, pH7.0

 

NMT实验标准化方案

·毒理研究NMT标准化方案

·斑马鱼NMT标准化方案

 

NMT仪器信息

·活体培养环境监测仪

·智能自动化非损伤微测系统

 

 

 

 

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0045653520313631

 

关键词：氨；侧线；毛细胞；MET通道；Ca²⁺内流；生医动物类

 

 

 

 

 

 

 

 

 

转自中关村旭月非损伤微测技术产业联盟

 

 

 

 林豊益《NMT在斑马鱼离子细胞的应用：从生理到环境毒理》

 

 

基本信息

主题：NMT发现精氨酸抗利尿激素敲低致斑马鱼胚胎离子细胞泌H⁺↓ 为探究其参与调节离子和酸碱平衡机制提供依据

期刊：International Journal of Molecular Sciences

影响因子：3.998（2020年）

研究使用平台：NMT斑马鱼创新平台

标题：Arginine Vasopressin Modulates Ion and Acid/Base Balance by Regulating Cell Numbers of Sodium Chloride Cotransporter and H⁺-ATPase Rich Ionocytes

作者：台湾大学周铭翊、中研院细胞与个体生物学研究所黄鹏鹏

 

检测离子/分子指标

H⁺

 

检测样品

斑马鱼胚胎皮肤离子细胞

 

中文摘要（谷歌机翻）

      精氨酸抗利尿激素（Avp）是一种保守的多效激素，已知可以调节水的重吸收和离子平衡。然而，影响其作用的许多机制仍不清楚。研究使用斑马鱼胚胎来研究Avp如何调节离子和酸碱稳态。将胚胎在双蒸水中孵育24 h后，avp mRNA表达水平显著上调。通过反义吗啉寡核苷酸（MO）敲低AVP蛋白表达的减少的离子细胞相关基因的表达和下调全身Cl^-含量和H⁺的分泌，而Na⁺和Ca²⁺水平不受影响。Avp拮抗剂SR49059的孵育也下调了氯化钠共转运蛋白2b （ncc2）的mRNA表达，后者是负责Cl^-吸收的转运蛋白。相应地，avp morphants显示较低的NCC和H⁺-ATPase富集（HR）细胞数目，但Na⁺/K⁺-ATPase富集（NaR）细胞数目保持不变。avp MO还下调了foxi3a和p63表达细胞的数量。最后，降钙素基因相关肽（cgrp）及其受体降钙素受体样1（crlr1）的mRNA表达水平在avp morphants中下调，表明Avp可能影响Cgrp和Crlr1调节Cl^-平衡。总之，本研究结果揭示了Avp调节离子和酸碱平衡的分子/细胞途径，从而提供了对其功能的新见解。

 

离子/分子流实验处理方法

斑马鱼胚胎在1-2细胞期

· 对照组

· 精氨酸抗利尿激素（Avp）敲低组

 

离子/分子流结果

      Avp敲低组斑马鱼胚胎离子细胞，H⁺分泌较对照组弱。

 

图1. 下调Avp对3dpf时卵黄囊离子外排的影响。正值代表Ｈ⁺外排。

 

 

其他实验结果

• Avp及其受体在斑马鱼组织中广泛表达。

• avp敲低下调Avp蛋白表达。

• Avp调节离子细胞的功能。

• Avp调节斑马鱼胚胎皮肤上的离子细胞数量。

• Avp敲低组显示Cgrp及其受体Crlr1的表达减少 。

 

结论

      研究在斑马鱼中观察到的Avp对体液Cl^-和酸碱平衡的积极调节作用，与它在哺乳动物肾脏中的已知生理功能相一致。本研究进一步揭示了Avp对Ncc2b和H⁺-ATPase在mRNA和蛋白水平上表达的新影响。研究首次证明Avp调节上皮干细胞和离子细胞祖细胞的细胞数量，以控制NCC和HR细胞的数量并调节Cl^-吸收和酸分泌。而且，这种调节机制可能是由Avp和Cgrp-Crlr1信号传导之间的串扰所介导的。有趣的是，斑马鱼的皮肤/鳃离子细胞和哺乳动物的集合管夹层细胞显示出类似的细胞分化途径，其中涉及类似的信号传导成分（即Fox和Notch）。目前关于斑马鱼Avp的研究结果为进一步研究Avp是否也通过调节哺乳动物肾脏的细胞分化来控制上皮的Cl^-吸收和酸分泌功能提供了依据。因此，本研究结果为荷尔蒙控制体液Cl^-和酸碱平衡提供了新的见解，增加了对脊椎动物内分泌学的了解。

 

NMT实验标准化方案

·斑马鱼NMT标准化方案

 

NMT仪器信息

·活体培养环境监测仪

·智能自动化非损伤微测系统

 

 

 

 

原文链接：https://www.mdpi.com/1422-0067/21/11/3957

 

关键词：抗利尿激素；离子细胞；离子调节；斑马鱼；Cl^-吸收；酸分泌；生医动物类

 

 

 

 

 

 

 

 

 

转自中关村旭月非损伤微测技术产业联盟

 

 

 

 

 

 

 

基本信息

主题：NMT发现盐分刺激下谷氨酰胺转运蛋白突变青鳉鳃上皮Na⁺流速下降 为谷氨酸/谷氨酰胺参与鳃细胞的渗透调节提供支持

期刊：Scientific Reports

影响因子：3.998（2020年）

研究使用平台：NMT斑马鱼创新平台

标题：Energy and nitrogenous waste from glutamate/glutamine catabolism facilitates acute osmotic adjustment in non-neuroectodermal branchial cells

作者：中央研究院细胞与个体生物学研究所曾庸哲、Pei-Chen Huang

 

检测离子/分子指标

Na⁺

 

检测样品

青鳉鳃上皮表面

 

中文摘要（谷歌机翻）

维持平衡是动物在渗透压扰动下最重要的生理反应之一。鳃上皮的离子细胞是负责主动离子转运的主要细胞类型，由耗能离子泵（如Na⁺-K⁺-ATPase、NKA）和次级主动转运蛋白介导。因此，除了渗透压调节外，充分和立即的能量补充对于适应渗透变化至关重要。本研究提出谷氨酸/谷氨酰胺分解代谢和含氮废物的跨上皮转运可能有助于广盐硬骨鱼日本青鳉（Oryzias latipes）适应渗透变化。在72 h的驯化期内，高渗刺激增加了鳃中谷氨酸家族氨基酸的含量。氨基酸的这种变化伴随着谷氨酸/谷氨酰胺转运体（Eaats，Sat）和合成酶（Gls，Glul）的刺激，它们在适应高渗条件期间参与调节鳃上皮中的谷氨酸/谷氨酰胺循环。谷氨酰胺酶和谷氨酰胺合成酶的原位杂交结合免疫细胞化学显示olgls1a和olgls2部分共定位，但olglul与富Na⁺/K⁺-ATPase的离子细胞不共定位。另外，对于谷氨酸和谷氨酰胺转运体，发现oleaat1、oleaat3和lslc38a4与离子细胞有共定位，而oleaat2没有共定位。Morpholino敲除Sat降低了幼鱼上皮的Na⁺流速，表明谷氨酸/谷氨酰胺转运在渗透调节中的重要性。除了作为能量底物的作用外，谷氨酸脱氨产生NH₄⁺，这可能有助于渗透物质的产生；编码尿素生产周期成分的基因，包括氨甲酰磷酸合成酶（CPS）和鸟氨酸转氨甲酰酶（OTC），在高渗刺激下上调。基于这些发现，目前的研究表明，谷氨酸/谷氨酰胺循环和随后的鳃上皮含氮废物的跨上皮转运是在高渗刺激下维持离子稳态的一个重要组成部分。

 

离子/分子流实验处理方法

对6-dpf青鳉注射1 ng SAT-吗啉修饰反义寡核苷酸（MOs）。

 

离子/分子流实验结果

      在20‰ salinity brackish water (BW)环境中，与Wt和Sham组相比，谷氨酰胺转运蛋白突变体组（Sat-MO）的鳃上皮Na⁺流速，显著下降（67%）。

 

图1. SAT-吗啉修饰反义寡核苷酸（MOs）对6 dpf 青鳉幼鱼卵黄囊上皮Na⁺流速的影响。正值代表Na⁺外排。

 

其他实验结果

• 与FW对照组相比，用20‰ BW处理72 h的青鳉的O:N比发生了明显变化。

• 与FW对照组相比，20‰BW处理后，青鳉鱼鳃中谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸和氨含量都有所增加。

• 20‰BW处理后，鳃组织中的尿素含量显著增加。

• 20‰BW处理后，olcps1、olotc上调表达，但是20‰BW在任何一个处理时间都没有明显诱导olcps2的表达；另外，Rh蛋白均下调表达。

• 72 h处理后，20‰BW暴露显著刺激olgls1a和olgls2的表达。然而，20‰的BW在任何一个处理时间都没有诱导olgls1b的表达；另外，20‰BW处理6 h和72 h后，glul的转录表达显著上调。

• olgls1a、olgls2和olglul三个基因都表现得卵黄囊鳃上皮细胞的典型特征。

• 谷氨酸转运体（Eaats）、olslc1a1、olslc1a2a、olslc1a2b和olslc1a3，以及谷氨酰胺转运体（SAT）、olslc38a4和olslc38a5均在青鳉鳃中表达。

• olslc1a1，olslc1a2b，olslc1a3和olslc38a4在卵黄囊的表皮细胞中表达，并表现出典型的“盐和胡椒样”模式表皮离子细胞染色。谷氨酸转运体直向同源物Eaat3部分与NKA信号共定位。此外，发现所有Eaat1的mRNA信号均与卵黄囊鳃上皮中的NKA阳性细胞和邻近的鳃上皮细胞共定位。

 

结论

      这项研究首次阐明了非必需的AAs，谷氨酸和谷氨酰胺是如何参与鳃内NH₃/NH₄⁺生成和尿素积累的，为渗透调节的能量学提供了新的见解。此外，谷氨酸/谷氨酰胺转运体和分解代谢调节剂Eaat、Sat、Gls和Glul在青鳉鳃上皮细胞中的表达模式不仅为研究功能不同的鳃上皮细胞之间潜在的AA转运途径提供了新的见解，同时也开始阐明谷氨酸/谷氨酰胺在鱼类渗透调节中的分子和细胞利用。此外，目前的研究表明谷氨酸-谷氨酰胺循环的特征可能通常来源于表皮的发育，因为在脊椎动物的神经外胚层衍生的中枢神经系统和非神经外胚层衍生的鳃上皮中都有发现。这些发现强调了通过谷氨酸/谷氨酰胺代谢产生基于NH₄⁺的尿素的重要性，这有助于在广盐硬骨鱼中建立良好的渗透调节能力（图2）。

 

图2. 谷氨酸是一种主要的等离子体驱动的能量底物，在应对盐分刺激时被转运到鳃中。

 

离子流实验使用的测试液

0.5 mM NaCl, 0.2 mM CaSO₄, 0.2 mM MgSO₄, 300 μM MOPS buffer, 0.3 mg·L^-1 ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate

 

NMT实验标准化方案

·斑马鱼NMT标准化方案

 

NMT仪器信息

·活体培养环境监测仪

·智能自动化非损伤微测系统

 

 

 

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41598-020-65913-1

 

关键词：Na⁺流速；青鳉；鳃上皮细胞；谷氨酸/谷氨酰胺；渗透刺激；生医动物类